生物化学与分子生物学：第21章DNA重组及重组DNA技术.pptVIP

本章小结 自然界基因转移伴发重组的几种形式：同源重组、位点特异的重组及转座重组；细菌的基因转移包括接合、转化、转导。 重组DNA技术中的工具酶，限制性内切酶的特点， α互补筛选的原理，基因重组的过程包括分、切、接、转、筛。 * * * 在重組中，RecA 蛋白負責基本的鹼基配對，但還需要另一些蛋白質來完成同源重組，其中最主要的是 RecBC 酶。 RecBC 酶是由 recB 和 recC 基因編碼的，其分子量約爲 300，300，具有使 DNA 解旋的和核酸酶活性。它能夠在單股 DNA上作一切口，從而使此單鏈（在與 RecA蛋白結合後）能侵入同源雙螺旋。RecBC酶的一個重要性質是它僅能在含有游離雙螺旋端的 DNA 分子上起始其解旋作用。 它首先結合在又螺旋的游離端上，然後利用 ATP 供給的能量沿著雙螺旋向前推進。在其行經之處，一路上解旋並又複旋。但由於解旋的速度快於複旋速度，所以解旋的雙鏈區就越來越長。因爲解旋和複旋作用的位點都必須結合在酶分子上，故在電子顯微鏡照片中這種解旋部分會形成兩個單鏈的環，稱爲“兔耳（rabbit ears）”。RecBC 酶的另一重要性質是它最喜歡在含有稱爲 Chi(％)位點的 DNA 分子上促進重組作用。Chi 的核苷酸順序是 5’GCTGGTGG3’。這些部位是重組頻率較高的部位。當解旋的 DNA 鏈上有 Chi 位點時，RecBC酶就是出現特異的核酸酶活性，能將靠近Chi 處（約離 Chi 4－6鹼基處）的單鏈切斷。這樣，當 RecBC 酶再向前進時，就不會再行複旋。這個後果就是留下了一個游離單鏈端和一段“空隙”。RecA蛋白就結合在此二者上，並能開始與同源序列進行DNA鏈交換。RecA蛋白需要的單股 DNA至少長約 50 核苷酸。 據報導，E.coli DNA上約有一千拷貝Chi 序列，或者說每５個基因便有1 個 Chi 作爲 RecBC 酶的作用部位。但在正常細胞中 RecBC 酶並不作用於 Chi 序列，因爲正常時DNA沒有游離端。但在細菌進行接合時，情況就不同了。因爲雄菌可將一個 DNA游離端送入雌菌，在雌菌體內 RecBC 酶立即結合在此游離端上並向前推進，在到達 Chi 時切割此鏈，從而促進此鏈與受體菌DNA發生重組。其他情況如噬菌體 P1 轉導細胞和噬菌體λ感染細胞時均可出現DNA游離端，並借助於 RecBC酶而發生重組。SSB也可帮助RecA,所以，RecBCD会紧密连接RecA,阻止SSB的结合。 RecBCD起作用需要有DNA双链断端，但迄今为止没有发现细菌中有引入双链断裂功能的蛋白质，实际上DNA损伤和复制叉停止等事件是产生双链断裂的主要来源。 * * * * 1.若重组位点存在于不同分子之间，发生插入（整合）重组 2.以相同方向位于同一DNA分子上：缺失 3.以相反方向位于同一DNA分子上：倒位 * * “十字架样交叉” * 鞭毛位于细胞表面，因而时常是免疫系统的识别目标 * 1983年，著名的诺贝尔生理学与医学奖，被一位8l岁高龄的老太太单独获得了。她身材娇小，但却精神矍铄，目光深沉。对于她来说，这一科学界至高无上的荣誉迟到了30多年，意味着其科研成果，在经历了长期不被理解和受冷落的遭遇后，终于被人们普遍接受了。然而，内心无比激动的她此时却格外平静地说：“我觉得自己获得这种意外的奖赏似乎有些过分。多少年来，我在对于玉米遗传的研究中已获得很多的快乐。我不过是请求玉米帮助我解决一些特殊的问题，并倾听了她那奇妙的问答。”　　就是这样一位其貌不扬，语言朴素的老人，在玉米遗传学的园地中辛勤耕耘了一辈子，以其独特的天赋和方式取得了非凡的成就，并提出了著名的“转座”理沦，在遗传学界享有极高的威望。她的名字就叫巴巴拉·麦克林托克。　　　　　　　　　　情有独钟　　巴巴拉·麦克林托克(BarbaraMeclintock)是美国著名女遗传学家。1902年6月16日，麦克林托克在美国康涅狄格州的哈特福德诞生。大概是受了父母勇敢，喜欢冒险性格的遗传，麦克林托克生性热爱自由，遇事都喜欢独立思考，而不愿受到世俗观念的羁绊。学生时代，她就对自然科学表现出浓厚的兴趣，尤其喜欢流连于让许多人头疼不已、退避三舍的难题之中，因为她觉得解决难题的关键，就在于找到一个恰到好处的视角，而这不仅是对一个人耐心和毅力的极大考验，更是对多角度思维能力的极好锻炼。从中，麦克林托克感受到了思考的莫大乐趣。正是这种乐趣吸引着她一生埋头于科学研究，而没有丝毫功利的目的。　　1919年．17岁的麦克林托克开始就读于康奈尔大学农学院。当时，这个学校的绝大多数学生都热衷干农艺学，因为这个专业比较实用，将来可以为找到一份好的工作带来很大的便利，而巴巴拉却对遗传学这门基础性学科有着强烈的兴趣。那时，遗传学界已认定