电泳技术原理及蛋白质的分离电泳实验课件.pptVIP

* * * * * 试剂 分离胶 浓缩胶 A液(ml) 3 0.45 B液(ml) —— 1.24 C液(ml) 1.9 —— 蒸馏水(ml) 3.33 1.0 10%SDS(ml) 90 30 1% TEMED(ml) 0.6 0.24 5%过硫酸铵（ml） 80 40 总体积(ml) 9 3 胶浓度 10% 4.5% 凝胶配方 操作要点 凝胶配制注意事项 1.按比例配好分离胶,用移液枪快速加入,大约5厘米左右,之后加少许蒸馏水（或异丙醇除泡）,静置至胶凝  * 凝胶配制过程要迅速, 催化剂TEMED要在注胶前再加入,否则凝结无法注胶。注胶过程最好一次性完成,避免产生气泡 * 水封的目的：保持分离胶上沿平直，排气泡 * 胶凝好的标志：胶与水层之间形成清晰的界面 丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺具有神经毒性，操作时要戴手套 凝胶配制注意事项 2.倒出水并用滤纸把剩余的水分吸干,按比例配好浓缩胶,连续平稳加入浓缩胶至离边缘5mm处,迅速插入梳子,静置到胶凝  * 梳子需一次平稳插入,梳口处不得有气泡,梳底需水平 3.拔出样梳后,拆掉密封条，在内槽中加入缓冲液 *用吸瓶将加样孔内和玻璃板下面放密封条位置的气泡全部排出 电泳注意事项 1.电泳槽中加入缓冲液(没过上样孔），电泳开始时电流恒定在10mA（100V），当进入分离胶后改为20mA（150V），溴酚蓝距凝胶边缘约数cm时，停止电泳  2.凝胶板剥离与染色：电泳结束后，撬开玻璃板，将凝胶板放在大培养皿内，加入考马斯亮蓝染色染色液，剥胶时要小心,保持胶完好无损,染色要充分 电泳注意事项 3.蛋白质变性 蛋白样品+ 2×上样buffer（1:1）混匀， 100℃沸水浴，5min 蛋白质变性还原成单一亚基结构 巯基乙醇的作用是使蛋白质分子中的二硫键还原 上样 Marker Sample 测量蛋白质移动距离 按下式计算相对迁移率：   迁移率计算 = 蛋白质移动距离 相对迁移率 脱色后凝胶长度 指示染料移动距离 染色前凝胶长度 X 每个蛋白标准的分子量对数对它的相对迁移率作图得标准曲线，量出未知蛋白的迁移率即可测出其分于量，这样的标难曲线只对同一块凝胶上的样品的分子量测定才具有可靠性 原始记录 染色前凝胶长（cm) 脱色后凝胶长（cm) 染料移动距离（cm） 相对分子量(kD) 蛋白质移动距离（CM) 迁移率平均值 130 95 70 55 43 33 25 20 15 样本 牛血清白蛋白 彩虹130 PR1950 实验报告 将原始记录置于第一页，装订一同上交 实验原理（清晰） 实验步骤（简略但清晰） 数据处理（数据带入的过程，若为定性实验则为观察到的现象） 实验结论 实验讨论（讨论实验成败的原因，实验可改良的地方等） * * 毛细管电泳是一类以毛细管为分离通道、以高压直流电场为驱动力的新型液相分离分析技术。实际上包含色谱、电泳及其交叉内容，其分离机制是靠色谱与电场两种作用，依据样品组分的分配系数及电泳的迁移率差别而分离。 * * * * * * * 常用的标准凝胶是指浓度为7.5%的凝胶，大多数生物体内的蛋白质在此凝胶中电泳，能获得满意的结果。 * 常用的标准凝胶是指浓度为7.5%的凝胶，大多数生物体内的蛋白质在此凝胶中电泳，能获得满意的结果。 * SDS是洗洁精的主要成分。 * * * 快离子很快移动到最前面，原来它停留在那部分地区则形成了低离子浓度区，即低电导区。低电导区有较高的电位梯度，就引起了电位梯度的突变。这种高电位梯度又使蛋白质阴离子和甘氨酸阴离子在此区域加速前进，追赶快离子。当快离子和慢离子的移动速度相等的稳定状态建立以后，快离子和慢离子之间造成一个不断向正极移动的界面。夹在快、慢离子间的样品蛋白质阴离子的移动界面就在这个追赶中逐渐被压缩，聚集成一条狭窄的区带。浓缩效应可使蛋白质浓缩数百倍。 * * * * * * PAG 的光聚合 催化剂：核黄素（VitB2）＋TEMED 核黄素在氧及紫外线作用下，生成含自由基的产物而引发聚合作用。 形成的凝胶孔径较大，随时间延长逐渐变小，不稳定 多用于制备浓缩胶 PAG 的优点 机械强度好，有弹性，透明， 相对化学稳定，对pH和温度变化较稳定， 在很多溶剂中不溶，没有吸附和电渗作用。 通过调节单体的浓度和交联度可以控制孔径大小 对所有蛋白质和肽都有筛分作用 制备凝胶的重复性好。 【凝胶总浓度及交联度对凝胶的影响】 凝胶溶液中单体和交联剂的总浓度和两者的比例是决定聚丙烯酰胺凝胶特性包括其机械性能、弹性、透明度、粘着度及孔径大小的主要因素。 T为凝胶总浓度，C为交联度。 a为丙烯酰胺单体的质量(g