逆转录PCR法分析小鼠肝糖代谢基因转录水平实验课件.pptVIP

引物设计的基本原则 3 引物长度一般为18-30碱基之间 2 避开易形成二级结构的模板序列区域 引物应具有足够的特异性 1 Tm之差1℃，最适退火温度55-60℃ 5 引物自身及引物之间不存在互补序列 7 G+C含量一般为40%-60% 4 引物中4种碱基最好是随机分布的 6 引物5’端可修饰，3’端不可修饰 8 Primer Premier 5.0 Oligo 6 Primer 3（在线） Primer-BLAST（在线） 引物设计常用软件 1 2 3 4 半定量 RT-PCR 半定量RT-PCR（semi-quantitatie reverse transcription and polymerase Chain reaction ,SqRT-PCR）是常用的一种简捷、特异的定量RNA测定方法，通过mRNA反转录成cDNA，再进行PCR扩增，并测定PCR产物的数量，可以推测样品中特异mRNA的相对数量。 半定量 RT-PCR---相关概念 平台效应 PCR扩增属于酶促反应，所以，DNA扩增过程遵循酶促动力学原理。靶DNA片段的扩增最初表现为直线上升，随着靶DNA片段的逐渐积累，当引物-模板/DNA/聚合酶达到一定比值时，酶的促化反应趋于饱和，此时靶DNA产物的浓度不再增加，即出现所谓平台效应。 灰度值（IOD值） 用凝胶成像系统自带的分析软件分析目的条带的平均密度值，也称为灰度值。是density和area的乘积。 半定量 RT-PCR---相关概念 管家基因 持家基因(house-keeping genes)：又称管家基因，是指所有细胞中均要表达的一类基因,其产物是对维持细胞基本生命活动所必需的。管家基因表达水平受环境因素影响较小，而是在个体各个生长阶段的大多数、或几乎全部组织中持续表达，或变化很小。它的表达只受启动序列或启动子与RNA聚合酶相互作用的影响，而不受其他机制调节。 不同组织或细胞来源的目的基因表达量不同，而管家基因的表达则相同（实际上在外因的作用下也会有差异） 半定量 RT-PCR---基本原理 PCR扩增反应是酶促反应，遵循酶促动力学原理，开始的循环内扩增产物呈指数积累，产物与模板呈线性关系。半定量RT-PCR技术正是利用产物与模板量的这一线性关系，通过扩增产物来对比总RNA中目的基因的表达。 2、以等量cDNA为模板，用特异引物进行扩增得到目的基因和管家基因的片段。 1、将RNA逆转录获得cDNA 3、灰度扫描软件（如Totallab或Bandscan)对目的基因扩增条带进行灰度扫描，经内参矫正后，得到一个相对值。 半定量 RT-PCR---基本流程 为避免RNA抽提、加样、测量、cDNA合成及PCR反应过程中的某些系统误差和人为误差，用半定量RT-PCR分析基因mRNA相对表达水平明必须引入内对照系统即内参。内参一般为管家基因。 不同的生物体其生命过程和生理过程各不相同，选用何种内参根据目的基因和实验的具体情况而定。为保证实验结果的可信度，每一次实验都必须做内参。 经常用于RT-PCR法的Control有：GAPDH、β-actin、18S rRNA、28S rRNA等 内参的选择 将要比较的两个样品的内参调成一样的亮度； 根据扩增内参时加入的cDNA量，进行目标基因的PCR扩增； 电泳扫描后，计算灰度值，先用一个标本的目标和内参进行比较，然后用这个相对值再去和其他你所要比较的平行组进行比较，一般每组3个样本以上。 举例---结果分析 试剂 剂量 10x PCR Buffer 5 ?l dNTP 4 ?l 模板DNA 2 ?l 引物1 2 ?l 引物2 2 ?l Taq 酶 0.5 ?l H2O 34.5 ?l Total 50 ?l 三、PCR——实验步骤 MKP-1 GLUT1 b- Actin/GAPDH PCR扩增条件 预变性 94℃ 5min 变性 94℃ 30s 退火 54℃ 30s 延伸 72℃ 30s 终延伸 72℃ 7min 30循环 四、琼脂糖凝胶电泳——实验原理 从琼脂中除去带电荷的琼脂胶后，剩下的不含磺酸基团、羧酸基团等带电荷基团的中性部分，结构是链状的聚半乳糖，易溶于沸水，冷却后可依靠糖基间的氢键引力形成网状结构的凝胶。 凝胶的网孔大小和凝胶的机械强度取决于琼脂糖浓度。因此琼脂糖凝胶可作为分子筛，常用于凝胶层析和电泳。 D2000 mark 1.上样：6×loading buffer(2ml)+ PCR产物(10ml) DNA Marker(DL5000) 10ml 2. 1%琼脂糖凝胶电泳,120V, 45min。 3. 紫外灯下观察结果