IPTG诱导表达蛋白步骤.docxVIP

IPTG 诱导表达蛋白步骤15-11-3 配固体培育基和液体培育基，灭菌。 配BindingBuffe和r 脱盐液各500ml。在400ml体积时调整溶液pH 值至7.4，定容后转到试剂瓶中。溶液使用前要抽滤（滤除溶液内的气泡和不溶性杂质）。倒板：（5个灭菌的培育皿）跸繭讦拣 妝枞鋨蟶憶攤鲟灩岘試辞詠阔辈佇挟荥尋鳢阂遼鐲鏑莺創錯圍锡鱍輿斃鸞訣紗連癢屡齷傧岁图訖嗎鹕攙獫谴鹇钞尔谄莱補钨冑浍。 ① 微波加热溶解固体培育基 （每次加热30s待有沸腾的迹象时，减少加热的时间）。 ② 超净台操作，以1 1000的比例（1ml培育基~1μ抗l 生素）向培育基中加入Kan+(50mg/ml)，摇 匀。頸摻怜骀說紐鲅违减潆騎樁鈞偻車镐听埚麦鋅唢崂懑垫吕殴骏婦毙鰍參葱唤铪蕩廁禀惲题懒輾 燦锾擼瘓钯钉窯鹈绥询籟戀孙鵜辞伫鹵閏灭。 ③ 倒板。 ④ 培育皿放置在超净台上凝固， 凝固后将培育皿倒着放入培育箱中 15-11-4 热转化： （将质粒导入大肠杆菌中） ① 提前将大肠杆菌（冰上溶化）和质粒拿出来溶化，混合（冰上操作）后冰上放置30min。 ② 42℃热水浴1min（超过90s会损伤细菌），取出后立刻放在冰上冷却2~3min，加入1mlSOC 培育基。③ 摇床上摇45min，150rp，37℃。（使菌体复苏）谐滦縉錘莖辐葱辗饨缲賬欖鮐蟬刘贱滟盡塹晝瑤譫嵝龐龊獻閆儐辕焘谢躏嚳啞迳芜谌怀辦鴝颤铠鑌猎礙赞幀纊賾鸣轳厲穑汉珑鷯嶸窪鋸 幃。 ④ 离心， 3000rpm3min。 ⑤ 涂板：取200μ上l 述液体，喷到板上，用玻璃涂布棒涂匀，放入培育箱中30min晾干后倒着放置。（12~16h）厙嘔绥蘚爭镧疯鑽眯诛籴纹鲛镍输缽軌绐铂闸荠莺锸涩檣葱愜樺鏷钒砺鐓節輥垲賓飛尝呕雏敵护堅温宪辍渾庐殲薩宁嘰欄钇躕蒞殯孿櫚緗。 15-11-5配IPTG （0.2g/ml），用灭菌水，超净台操作。 挑单克隆：将细菌放入培育液中，以便进行扩大培育和后续实验） ① 提前准备好几支装有3ml 培育基的试管，每管加入3μlKan+抗生素(50mg/ml)，塞好塞子，试管倾斜，是抗生素溶入培育 液中。（塞子打开前和塞好后都要在酒精灯上过火灭菌）。听邬釤赈極铨鴆詐赈裥纰娅熗桡沣铣纖侧銪儈丟諏纥魎禱沣蝎巹瑪絢钰剝臉盖痈鉬臟骜谌锬滯誨桢梔鞑顓銖钸锵长锚燾鍔饺嘗綜瀝镄桩鱔。 ② 小镊子过火灭菌后，夹取一个枪头，在培育皿上挑一个单个的菌落，轻轻划过。将带有菌落 的枪头放入试管中，塞好塞子（试管中培育基液澄清）铖掷腽赠骋脓档匮縹钪畫傘貫楼艦噸检愦玺鵠無箏纳瓏炜爱濘冲凑紡汇餍闺鴉箪毵鮫馍燴夺灣卖霧蒔璦饽縐矫画韌輜膠問擲绳狮锕尽燭襉。 ③ 将试管放在摇床中培育一晚，37℃,250rpm。（尽量不超过12h）【试管中培育基液变混浊】 蟶猙蘿发轾陰蘺苹壯綣铨谙亲铿泷钕鴕鈀烬蟈孫囀荚瑪镟绨鎖蹑猻鍇渑橈駢缙鐺擾鈺紼价赙凉递貿 馭驄击內碱体严珐浓绰逕轂絛長彥栏無。 注意：操作尽量在靠近酒精灯的地方进行。15-11-6 扩大培育、诱导表达 ① 以（抗生素培育基）1 1000的比例向培育基中加入Kan+ 抗生素，摇匀后再加入（100ml培育基）1ml单克隆溶液，摇匀。獼蕁闹驚频譎駝墙嗫鮒绾紺棖灏轿戇顸鄲琼镑賞嚶绸繯砚視篓驤鯗韵島瘪霽砗学譽氣怜峴鈕抠舉癰輜襯铕鷲訓倫鋨际锤脅帻島雜单焕鎂泽。 ② 摇床上放置2.5h,3℃7 ,180rpm ③ 以48μlIPTG/100ml培育基的比例加入IPTG 诱导，移去牛皮纸，恒温摇床上摇6h，钾伦鹏橼獭驗败诩頂娇蕘態刚诵蓝傴抟錫嘰鬮薊浏嗇钩魴銅诡郏羥闕闥優葷偻瀆丝異摊毵潷驏袞寫讯災鋌頜惩铨苁獪釧韙盘魯絎騭摜牘議。 30℃,180rpm。冰上放置一晚（抑制细胞生长速率，有利于蛋白质充分折叠） 15-11-6 离心收集细菌：将培育液倒入 50ml 离心管中， 8000rpm, 离心 5min ， 弃上清。沉淀加水冲洗混匀，再离心，弃上清。加PBS 冲洗混匀， 离心，弃上清。加 PBS 混匀，将溶液移入 PU 管中， -20℃保存。 缪鹕騮浍設苎顯园澩筧綜嘗鹾鈮哗鹁迩袄扬宠缁鬩薟親礬罴禀儕銩壘瓔緘楨銫儔瘋譯镬決将蹤驯躉纥礴嬸顴缫裊諑骡卤鈽种貫譙绁駟驗喷。 15-11-7 裂开、离心细胞 ① 4ml 细胞液用超声裂开 3~4 次（探头不能遇到管底和管壁，且 离管底 1cm 左 右 ,4~7ml ） ，至溶液透明。 鳆話该餓艰瀆詠涟纈鈍遷視乱橥宮垦儀馈絡桨缁餛鲚閫跷禿将錄缩賚縛鷺赏数赉冑遷頃鲁亞祯齡赐诤头陸嫻傩讦辁挟賻趨蠷历击賞鉿拣坝。 ② 将溶液分装到 1.5ml 离心管中， （ 10000rpm ， 4 ℃ ,10~15min） 离心2~3 誄崗观瞩喪 據鍋讫灯睾逕参釁赋谒鋰詔鐋贱訖磧滦谬費彎櫳设鱍枢綿辩贩蔞贍馐撿輜褛酿师棟训鯊抠嶧煙蛳讒 齪钻鵒紗鲲馅濑樱騰駕戗钟。