食品快速检测技术1.1荧光定量PCR技术原理（有资料）荧光定量PCR原理电子教材.docxVIP

电子教材 《食品快速检测技术》电子教材 荧光定量PCR原理 一 基本概念 理论上，PCR 过程是按照2n（n 代表PCR 循环的次数）指数的方式进行模板的扩增。但在实际的PCR 反应过程中，随着反应的进行由于体系中各成分的消耗（主要是由于聚合酶活力的衰减）使得靶序列并非按指数方式扩增，而是按线性的方式增长进入平台期。因此在起始模板量与终点的荧光信号强度间没有可靠的相关性。如采用常规的终点检测法（利用EB 染色来判断扩增产物的多少，从而间接的判断起始拷贝量），即使起始模板量相同经PCR扩增、EB 染色后也完全有可能得到不同的终点荧光信号强度。 为了能准确判断样品中某基因转录产物（mRNA）的起始拷贝数，实时荧光定量PCR采用新的参数——Ct值，定量的根本原理是Ct值与样品中起始模板的拷贝数的对数成线性反比关系。 1. Ct值是如何得到的 在实时荧光定量PCR的过程中，靶序列的扩增与荧光信号的检测同时进行，定量PCR仪全程采集荧光信号，实验结束后分析软件自动按数学算法扣除荧光本底信号并设定阈值从而得到每个样品的Ct值。 图1 荧光扩增曲线 2. Ct值的定义 Ct值中的“C”代表Cycle（循环），“t”代表检测threshhold（阈值），其含义是PCR扩增过程中荧光信号强度达到阈值所需要的循环数；也可以理解为扩增曲线与阈值线交点所对应的横坐标。 3. Ct值与样品中模板的对应关系 Ct值与样品中起始模板的拷贝数的对数成线性反比关系（y=ax+b，x 代表起始模板拷贝数的对数，y代表Ct 值）。 图2 标准曲线 4. 与终点法相比利用Ct值的优势 由于Ct值是反映实际PCR反应过程中扩增即将进入指数期的参数，该参数几乎不受试剂消耗等因素的影响，因此利用Ct值判断的起始模板拷贝数更加精确，重复性也更好。传统的终点检测法是在PCR 扩增经历了指数扩增期进入平台期后利用EB 等染料染色来判断扩增产物的多少，从而间接的判断起始拷贝量，这种方法的精确度不高、重复性也不好。 下图中是96 个复孔的实时扩增曲线（完全相同的反应体系、相同的反应protocol、相同的样品起始浓度），可以看到Ct 值具有很好的重复性，而终点的荧光信号强度差异达到300个单位。 图3 实时扩增曲线 此外，采用实时荧光定量PCR 还能从方法学上有效的防止PCR 实验中交叉污染的问题。因为荧光定量PCR 中模板的扩增与检测是同时进行的，当实验完成后即可获得定量结果，直接丢弃含有大量扩增产物的反应管，彻底避免了传统方法中取出扩增产物进行电泳鉴定时扩增产物对实验室造成二次污染的可能性。 二 定量方法 1. 绝对定量 采用绝对定量的方法需要使用标准品（已知起始拷贝数的样品）建立标准曲线，建立Ct值与样品起始模板拷贝数的对数之间的线性关系，从而通过实验后样品的Ct值得出起始模板量。 标准品的种类：含目的基因的质粒（经酶切线性化处理，其中的插入片段必须采用与QPCR实验中相同的引物扩增得到）、PCR扩增产物（经纯化，必须采用与QPCR实验中相同的引物扩增得到）、化学合成的寡聚核苷酸、cDNA、gDNA等，前2种标准品使用较为广泛。 标准品的定量：UV A260、荧光分光光度检测等。 为了使实验最终得到的Ct值之间具有可比性，必须进行归一化的处理：1，对各样品进行细胞计数，使各样品的起始细胞数一致（可操作性不强，尤其是针对组织、肿瘤等样品）；2，对纯化后得到的总RNA进行定量，使各样品进行RT-PCR时加入的RNA用量一致。 2. 相对定量 与绝对定量不同，相对定量不关心每个样品中目的基因表达产物（mRNA）的具体拷贝数，而关注目的基因在不同的细胞类型、不同的发育周期等条件下不同的转录效率，即基因的差异化表达。就研究目的而论，该方法比绝对定量的应用范围更广泛、更符合研究的目的。某目的基因在样品与对照品间表达差异倍数的计算公式如下： 公式说明： Rel.Quantity：目的基因在样品与对照品间表达差异的倍数； GOI：目的基因（Gene of Interest）； Norm：内参基因（Reference Gene，Normalizer，House Keeping Gene） Eff：PCR扩增效率，分子部分为目的基因扩增效率，分母部分为内参基因的扩增效率； 使用该公式时，需要通过实验分别确定目的基因与内参基因的扩增效率然后代入公式进行计算；如果目的基因与内参基因的扩增效率都接近于100%且相差小于5%，也可将PCR扩增效率默认为100%，这样公式就简化为2-ΔΔCt 。 为什么需要设立内参基因？ 如果仅仅比较目的基因的ΔCt是不能准确反映样品间目的基因的表达差异的，最主要是受到3个变量的影响