食品快速检测技术2.1环介导等温扩增原理（有资料）环介导等温扩增技术原理电子教材.docxVIP

电子教材 《食品快速检测技术》电子教材 环介导等温扩增技术原理 一 概念 环介导等温扩增（Loop-Mediated Isothermal Amplification，LAMP）技术是日本学者Notomi T于2000年发明的一种新的DNA扩增技术，该方法能够高效、特异、快速的在等温条件下完成。通过一系列的链置换扩增反应，该方法能够在1h内就可以将靶基因扩增109倍，当靶基因为RNA时，该方法还可以通过在反应体系中添加反转录酶而实现对RNA的扩增；在LAMP反应中，会有大量的DNA合成，因此会产生很多焦磷酸根离子，这些焦磷酸根离子可以结合溶液中的二价Mg2+形成不容的焦磷酸盐，便于对反应结果的观测，使扩增和检测一步就可以完成，大大提高检测效率。 二 原理 1. LAMP反应的基本原理 该技术根据靶基因的6个区域设计出4条引物，包括两条内引物和两条外引物，其中内引物由靶序列正义链和反义链的两个特异区域组成，利用DNA链在60-65℃的恒温条件下处于解链和退火的动态平衡状态，在DNA聚合酶的驱动下结合靶序列启动DNA合成，由于内引物同时和双链互补，因此是形成环状结构的主要因素；外引物与内引物前端的序列互补，通过链置换DNA聚合酶的作用置换下内引物合成的DNA链并且合成自身DNA，被置换的链自身形成茎-环结构接着与内引物结合进行扩增和链置换，新合成的茎-环结构的长度是原来的二倍，如此经过滚环扩增之后形成的产物是周而复始的插入靶序列的不同长度的茎-环结构的DNA链，即由很多重复的环组成的花椰菜结构。为了提高反应速度，还可以通过引入两条环引物加快反应，环引物与合成过程中形成的环状区域互补，增加了在LAMP反应中DNA合成的起点数量，可大大缩短检测时间，提高检测效率。 2. 分步原理 与普通PCR方法不同之处在于无需加热到使双链DNA解旋到两条单链的变性温度就可以驱动反应的进行，针对靶基因的6个特性性区域的引物结构如下图所示，其具体合成步骤如下： 图1 LAMP原理图 第1阶段为起始阶段： 第一步：内引物FIP与模板链复性结合，以FIP引物中的F2区域3’端为起点，在Bst DNA聚合酶的链置换活性的驱动下合成与靶序列互补的一条新链。 第二步：F3引物结合位于FIP前端的F3c区域开始链置换DNA合成，将之前FIP合成的序列置换下来，同时与模板链相互配对，合成自身序列，形成以F3引物为起点的双链DNA；被F3引物置换下来的链成为一条单链，由于这条单链上存在自身互补的序列，因此，FIP引物5’F1c区域与这条单链上的F1区域互补，自身配对形成茎-环结构。 第三步：下游引物BIP中的B2区域与被置换下来的这条单链相结合开始DNA合成。通过这一过程，之前上游形成的环状结构恢复为线性结构，随后由下游的B3引物将其和成的单链置换下来；同时也进行自身序列的合成，从而形成由F1到B3的双链DNA。 第四步：被置换下来的单链DNA两端分别与内引物相结合，因而可以与自身配对在两端分别形成茎-环结构，被称为哑铃结构，该结构是LAMP扩增循环的起始结构。 第2阶段是扩增循环阶段： 第一步：以上述的哑铃结构F1的3’末端进行合成延伸，并且打开5’末端的环。 第二步：以茎环状结构为模板，FIP与茎环的F2c区结合，开始链置换合成；同时3’末端B1c和B1区域互补，在3’末端形成茎环结构，以自身结构为模版，B1的3’端区域为起点进行DNA合成，释放出带有FIP的互补序列。 第三步：上一步中形成长短不一的2条新茎环状结构的DNA，接着BIP引物上的B2与它们杂交，启动新一轮扩增。 3. LAMP引物设计原则 LAMP技术扩增基因的关键是设计出4条特异性的引物，从需要扩增的靶序列中选出F3c、F2c、F1c、B1、B2、B3 六个特定的区域，利用在引物设计软件Primer Explorer V4 (http://primerexplorer.jp/e/)即可完成；在引物设计过程中，为了得到理想的引物，需要注意以下几点： 被扩增的靶序列长度最好不要超过200bp。 内引物的末端最好不要富含AT碱基对，其末端稳定性自由能（△G）值应该小于-4kcal/mol。 每条引物的Tm值应该在55~65℃之间，最大限度的发挥酶的活性。 针对靶序列的各个区域，F2区域的5’到F1区域的5’末端以及B2区域的5’末端到B1区域的 5’末端之间的距离最好在40~60bp；F2区域的5’末端到B2区域的5’末端之间的距离最好在120bp~180bp。