2021年氨基酸纸层析法.docx

精品学习资料 名师归纳总结——欢迎下载 试验二氨基酸纸层析法一，试验目的1，学习并明白安排层析的原理；2，把握纸层析法分别氨基酸的原理和步骤； 二，试验原理纸层析法 (paper chromatography)是生物化学上分别，鉴定氨基酸混合物的常用技术，可用于蛋白质的氨基酸成分的定性鉴定和定量测定；纸层析法是用滤纸为支持物进行层析的方法，所用展层溶剂大多由水和有机溶剂组成，滤纸纤维与水的亲和力强，与有机溶剂的亲和力弱，因此在展层时，水是固定相，有机溶剂是流淌相；溶剂由下向上移动的，称上行法；由上向下移动的，称下行法；将样品点在滤纸上( 此点称为原点 ) ，进行展层，样品中的各种氨基酸在两相溶剂中不断进行安排； 试验二 氨基酸纸层析法 一，试验目的 1，学习并明白安排层析的原理； 2，把握纸层析法分别氨基酸的原理和步骤； 二，试验原理 纸层析法 (paper chromatography) 是生物化学上分别，鉴定氨基酸混合物的常用技术，可用 于蛋白质的氨基酸成分的定性鉴定和定量测定； 纸层析法是用滤纸为支持物进行层析的方法， 所用展层溶剂大多由水和有机溶剂组成， 滤纸纤维与水的亲和力强， 与有机溶剂的亲和力弱， 因此在展层时，水是固定相，有机溶剂是流淌相；溶剂由下向上移动的，称上行法；由上向 下移动的，称下行法；将样品点在滤纸上 ( 此点称为原点 ) ，进行展层，样品中的各种氨基酸 在两相溶剂中不断进行安排；由于它们的安排系数不同，不同氨基酸随流淌相移动的速率就 不同，于是就将这些氨基酸分别开来，形成距原点距离不等的层析点； 溶质在滤纸上的移动速率用 Rf 值表示： Rf=原点到层析斑点的距离 / 原点到溶剂前沿的距离 在肯定条件下某种物质的 Rf 值是常数； Rf 值的大小与物质的结构， 性质， 溶剂系统， 温度， 湿度，层析滤纸的型号和质量等因素有关；只要条件 ( 如温度，展层溶剂的组成 ) 不变， Rf 值 是常数，故可依据 Rf 值作定性判定； 样品中如有多种氨基酸， 其中某些氨基酸的 Rf 值相同或相近， 此时如只用一种溶剂展层， 就 不能将它们分开；为此，当用一种溶剂展层后，将滤纸转动 达到分别目的，这种方法称为双向纸层析法； 90 度，再用另一溶剂展层，从而 氨基酸无色，可利用茚三酮显色反应，将氨基酸层析点显色作定性，定量用； 三，药品器材 1 试验器材 混合氨基酸溶液 （蛋清或血清水解后的氨基酸干粉） 6mg/ml ，滤纸， 烧杯 10ml( × 1) ，剪刀， 层析缸（× 2），微量注射器 光度计 2 试验试剂 (1) 溶剂系统 10( × 1) 或毛细血管，电吹风（× 1）， 722 型（或 7220 型）分光 碱相溶剂： V[ 正丁醇（ 酸性溶剂： V[ 正丁醇（ A.R. ） ]:V(12 ％氨水 A.R. ） ]:V(80 ％甲酸 ):V(95 ％乙醇 )=13:3:3 ):V( 水 )=15:3:2 (2) 显色贮备液 :V(0.4mol/ 茚三酮 - 异丙醇 ):V( 甲酸 ):V( 水 )=20:1:5 ； (3)V(0.1 ％硫酸铜 :V(75 ％乙醇 )=2:38 溶液，现配现用； 四，试验方法 滤纸预备：选用新华 1 号滤纸，裁成 24cm×28cm 的长方形，在距纸一端 2cm处用铅 笔轻轻划一基线，在线上每隔 3cm，画一小点样的原点； 点样：用毛细管吸取少量氨基酸样品点于原点 ( 分批点完 ) ，用吹风机稍加吹干后再点 下一次，重复 3 次，点子直径不能超过 0.5cm； 展层：将点好样的滤纸，用白线缝好，制成圆筒，原点在下端，浸立在培育皿 内，不需平稳，立刻展层；展层剂为酸性溶剂系统 把展层剂混匀 [V( 正丁醇 ) ： V( 甲酸 ) ： V( 水 )=15:3:2] ， 第 1 页，共 3 页 精品学习资料 名师归纳总结——欢迎下载 ，倒入培育皿内， 同时加入显色贮备液( 每 10ml 展层剂加 0.1-0.5ml的显色贮备液 ) 进行展层，当溶剂展层至距滤纸上沿1-2cm 时；显色：展层毕，取出滤纸，用热风吹干，蓝紫色斑点即显现；结果：用铅笔轻轻描出显色斑点的外形，并用始终尺度量每一显色斑点中心与原点之间的距离和原点到溶剂前沿的距离，运算各色斑的定混合物中含有哪些氨基酸； 五，试验结果Rf 值，与标准氨基酸的Rf 值对比，确由层析滤纸图可得：溶剂前沿距原点8.57m；单一氨基酸溶液各自的Rf 值脯氨酸的 ，倒入培育皿内， 同时加入显色贮备液 ( 每 10ml 展层剂加 0.1-0.5ml 的显色贮备液 ) 进行展层，当溶剂展层至距滤纸上沿 1-2cm 时； 显色：展层毕，取出滤纸，用热风吹干，蓝紫色斑点即显现； 结果：用铅