第三章第二节基因工程载体.pptxVIP

第二节 基因工程的载体;质粒载体 ;一、质粒的一般生物学特性;;（二）、质粒的拷贝数与不亲和性;二 质粒DNA的分离与纯化;三、质粒载体的构建及类型;（一）发展概况;（二）载体特点;（三）遗传标记基因;2、?标记基因的种类 1）抗性标记基因（可直接用于选择转化子） 主要是抗生素抗性基因: Ampr ，Tetr ，Cmlr，Kanr，Strr 2）生化标记基因 其表达产物可催化某些易检测的生化反应，如lacZ 3、常用的遗传标记基因及其作用机制 1) 四环素抗性基因（ Tetr ，Tcr） Tetracycline 可结合在核糖体30s亚基中的一种蛋白质分子上，抑制核糖体的转位过程。四环素抗性基因编码一种399 AAs蛋白质，与细菌细胞膜结合，阻止四环素分子进入细菌细胞。 2) 氨苄青霉素抗性基因（ Ampr ，Apr） Ampicillin可抑制细菌细胞膜上参与细胞壁合成酶类的活性。Apr抗性基因编码一种分泌到细菌细胞周间质的酶，可特异地切割氨苄青霉素的β—内酰胺环，使氨苄青霉素失活。;3) 氯霉素抗性基因（ Cmlr ，Cmr） Chlorophenicol可结合在核糖体50 S亚基上，阻止蛋白质合成。Cmr基因编码氯霉素乙酰转移酶，使氯霉素乙酰化，导致乙酰化的氯霉素不能结合在核糖体上。 4) 卡那霉素(Kanr), 新霉素(Neor)和G418抗性(G418r)基因 Kanamycin，Neomycin和G418均属脱氧链霉胺氨基葡萄糖苷类抗生素，可结合在核糖体上阻止蛋白质的合成。Kanr等抗性基因均可使这类抗生素磷酸化，使之不能进入细胞内。;5）β—半乳糖苷酶基因（lacZ 和lacZα） β—半乳糖苷酶基因有1021 AAs，基因产物装配为四聚体后才有酶活。该蛋白质可分为两部分：α链和β链。前者负责四聚体装配，后者具β—半乳糖苷酶活性；只有当两者都存在时，才会表现出酶活性，该作用称之为α-互补作用。这两个部分可独立存在， 分别由两个基因编码。为α链编码的基因称之为lacZα(编码145 AAs)。这两个基因（LacZ和LacZα）均可作为标记基因。 lacZ（lacZα）中含有多克隆位点，当无外源DNA片段插入时，质粒表达β—半乳糖苷酶的α-肽，与缺失突变体宿主菌（不能编码α-肽）表达的lacZ基因产物（ β链）互补，产生有活性的β—半乳???苷酶，在含有指示剂X-gal和诱导剂IPTG的存在下，菌落呈现兰色；外源基因的插入后，破坏了lacZ α-肽基因的结构，细菌内不能产生β—半乳糖苷酶活性，菌落呈白色。 β—半乳糖苷酶基因的优点: a.?酶催化X-Gal水解为兰色产物，检测直观 b. lacZα编码5‘-端可容许很大的变化（如加入多克隆位点）而不影响酶活性 c. lacZα和β链基因的分别表达可使载体小而容量大;;（四）、质粒载体的类型;2、根据载体功能划分 （1）. 普通型载体 (1) 特点: 至少有一个以上的克隆位点和两个标记基因，其中一 个用于转化体选择，另一个用于重组子检测。 ( 2) 用途: 基因组或cDNA文库的构建; 亚克隆(subcloning)或限制酶谱分析；外源DNA扩增。 例子: pBR322和pUC载体。 上述两例中的非重组子来源有两个： a.? 酶切反应时仍未被作用的pBR322或pUC18分子 b. 酶切后的载体分子经自我连接又形成载体分子;普通型载体pBR322的结构图;pUC18和pUC19载体;（2）、表达型载体（expression vector） 1)?特点: a. 基因的启动子序列和终止子序列； b. 一般无检测标记基因； c.? 克隆位点是确定的（即位于启动子序列后）； d. 重组分子用凝胶电泳检出（依赖于分子量差异）。 2)?结构: a. 转化单元--宿主细胞转化 b. 表达单元--外源基因表达 3) 类型: Ⅰ型：转录起始区（调控序列+启动子）+ 终止子 Ⅱ型: 转录起始区 + 翻译起始区（核糖体结合序列和起始密码子）+ 终止子 Ⅲ型: 转录起始区 + 翻译起始区 + 信号肽链编码区 + 终止子（常称之为表达分泌型载体）; 显然, 不同类型载体中所缺少的部分必须由外源基因提供。换言之,被表达的外源基因一旦确定, 表达载体的类型也就确