单克隆抗体制备流程图.docxVIP

文档内容来源于：网络收集整理，word版本可编辑，欢迎下载支持 文档内容来源于：网络收集整理，word版本可编辑，欢迎下载支持 单抗制备流程 1975 年,Kohler 与 Milstein 发觉将小鼠骨髓瘤细胞与绵羊红细胞免疫的小 鼠脾细胞进行融合 , 形成的杂交细胞既可产生抗体 , 又可无限增殖 , 从而创立了单克隆抗体杂交瘤技术； 这一技术上的突破不仅为医学与生物学基础讨论开创了新纪元, 也为临床疾病的诊，防，治供应了新的工具； 制备单克隆抗体包括动物免疫，细胞融合，选择杂交瘤，检测抗体，杂交瘤 细胞的克隆化，冻存以及单克隆抗体的大量生产 , 要经过几个月的一系列试验步骤, 下面依据制备单克隆抗体的流程次序 , 逐一介绍其试验方法； 一，细胞融合前预备 ( 一) 免疫方案 选择合适的免疫方案对于细胞融合杂交的胜利 , 获得高质量的 McAb 至关重要；一般要在融合前两个月左右确立免疫方案开头初次免疫 , 免疫方案应依据抗原的特性不同而定； 1，颗粒性抗原免疫性较强 , 不加佐剂就可获得很好的免疫成效； 下面以细胞性抗原为例的免疫方案 : 初次免疫 1× 10７／ 0，5ml ip ( 腹腔内注射 ) ↓ 2～ 3 周后 其次次免疫 1× 10７／ 0，5ml ip ↓ 3 周后 加强免疫 ( 融合前三天 ) 1× 10７／ 0，5ml ip 或 iv( 静脉内注射 ) ↓ 取脾融合 2，可溶性抗原免疫原性弱 , 一般要加佐剂 , 常用佐剂 : 福氏完全佐剂 , 福氏不完全佐剂；要求抗原与佐剂等体积混合在一起 , 研磨成油包水的乳糜状 , 放一滴在水面上不易立刻扩散呈小滴状说明已达到油包水的状态； 商品化福氏完全佐剂在使用前须振摇 , 使沉淀的分枝杆菌充分混匀； 初次免疫 Ag 1～50μ g 加福氏完全佐剂皮下多点注射 文档内容来源于：网络收集整理，word版本可编辑，欢迎下载支持 文档内容来源于：网络收集整理，word版本可编辑，欢迎下载支持 │ ( 一般 0，8～1ml 0，2ml／点) ↓3 周后 其次次免疫 剂量同上 , 加福氏不完全佐剂皮下或 ip │ (ip 剂量不宜超过 0，5ml) ↓3 周后 第三次免疫 剂量同上 , 不加佐剂 ,ip │ (5 ～7 天后采血测其效价 , 检测免疫成效 ) ↓2～3 周后 加强免疫 , 剂量 50～ 500μg 为宜,ip 或 iv ↓3 天后取脾融合 目前, 用于可溶性抗原 ( 特殊就为一些弱抗原 ) 的免疫方案也不断有所更新 , 如①将可溶性抗原颗粒化或固相化 , 一方面增强了抗原的免疫原性 , 另一方面可降低抗原的使用量；②转变抗原注入的途径 , 基础免疫可直接采纳脾内注射；③ 使用细胞因子作为佐剂 , 提高机体的免疫应答水平 , 促进免疫细胞对抗原反应性； ( 二) 饲养细胞 在制备单克隆抗体过程中 , 很多环节需要加饲养细胞 , 如: 在杂交瘤细胞选择，克隆化与扩大培育过程中 , 加入饲养细胞就为非常必要的；常用的饲养细胞有: 小鼠腹腔巨噬细胞 ( 较为常用 ) ，小鼠脾脏细胞或小鼠胸腺细胞 , 也有人用小鼠成纤维细胞系 3T3 经放射线照耀后作为饲养细胞 , 使用比较便利 , 照耀后可放入液氮罐长期储存 , 随用随复苏； 小鼠腹腔巨噬细胞的制备 小鼠采纳与免疫小鼠相同的品系 , 常用 BaLb／ c 小鼠 6～ 10 周龄 ↓ 拉颈处死 浸泡于 75％酒精 , 消毒 3～ 5 分钟 ↓ 文档内容来源于：网络收集整理，word版本可编辑，欢迎下载支持 文档内容来源于：网络收集整理，word版本可编辑，欢迎下载支持 用无菌剪刀剪开皮肤 , 暴露腹膜 ↓ 用无菌注射器注入 6～ 8ml 培育液 ↓ 反复冲洗 , 吸出冲洗液 ↓ 放入 10ml 离心管,1200 转／分别心 5～6 分钟 ↓ 用 20％小牛血清 (NCS)或胎牛血清 (FCS)的培育液混悬 , 调整细胞数 1 × 10５／ ml ↓ 加入 96 孔板,100 μl ／孔 ↓ 放入 37℃ CO2孵箱培育 一般饲养细胞在融合前一天制备 , 一只小鼠可获得 5～8×106 腹腔巨噬细胞 , 如用小鼠胸腺细胞作为饲养细胞时 , 细胞浓度为 5×106／ml, 小鼠脾细胞为 1× 106／ ml, 小鼠的成纤维细胞 (3T3)1 ×105／ ml, 均为 100μ l ／孔； ( 三) 骨髓瘤细胞 骨髓瘤细胞系应与免疫动物属于同一品系杂交瘤细胞在同一品系小鼠腹腔内产生大量 , 这样杂交融合率高 McAb； , 也便于接种 常用骨髓瘤细胞系有 :NS1，SP2／0，X63 Ag8，653 等； 骨髓瘤细胞的培育适合于一般的培育液 , 如 RPMI1640,DMEM培育基；小牛血清的浓度一般在 10～ 20％