甘油管冷冻保藏方法总结.pdfVIP

甘油冷冻保藏法 本方法适合于中、长期菌种保藏，保藏时间一般为 2-4 年左右。 （1）用火焰灭菌的接种环取斜面菌种在平皿上划线分离单菌落。 （2 ）平皿倒置于 30℃或 37℃恒温培养箱，培养 24-48 小时，至单菌落的大小为 3mm 左右。 （3 ）挑取一个单菌落， 接种于一个装 50mL 的 300mL 三角瓶中 30℃或 37℃振荡培养 10-15 小时，至菌密度 OD600 为 1.0-1.5。 （4 ）用火焰灭菌的接种环取少量种子液，涂片后，作革兰氏染色，在显微镜下观察菌体的 形态，及是否有杂菌。 （5 ）按 30%甘油：种子液为 1：1 （V/V ）的量加入无菌甘油， 混合后分装至事先灭菌的 菌种保存管（ 1-2mL/ 管）， -70 ℃或液氮保存。 用甘油保存过细菌，酵母，霉菌和放线菌， 40%-50% 的甘油是它的最终浓度。甘油浓度过低低温保存易结 冰，使菌死亡。 我同学有直接将菌液 -20 保存的， 不加任何保护剂， 但保存的时间很短， 他们保存过一年的， 但很多有死掉的。 我们做大肠杆菌感受态， 最终甘油是 15%的浓度，有时结冰也会使菌死掉。 我用 40%-50% 的甘油最终浓度一直很好，也不结冰。甘油一般是用那种蓝盖的小管（ 1 毫升）灭菌，放 0.7 毫升左右的甘 油，然后加菌悬液 0.1 至 0.2 毫升即可。甘油菌种比列为 7：1. 甘油管保藏与活化：在做一丝状真菌的甘油管保藏（ -80 度超低温保存，以甘油做保护剂） ， 大家提点建议。 是将菌在液体摇瓶中培养后将菌液与甘油混合、 将固体培养的菌块捣碎成菌 液再与甘油混合，还是直接将菌块挑至甘油中甘油与菌液的比值多少最合适，等等。 用该法保藏过的菌种，如何活化 ? 保种的菌先接种在培养液里活化好；配置 50% 的甘油溶液，灭菌； 1：1 加入，直接放入 -80 度；复苏的时候，冰上融化，直接接入培养液中。 除了可以用液体培养基菌丝保藏外。 要是你要保藏的丝状真菌能产孢子的话， 还可以制成孢 子悬浮液保藏，这样保藏的时间能长了些 ,到时活化的几率也大。 制备过程大致如下： 用无菌的蒸馏水将丝状真菌斜面孢子洗出， 接着用带脱脂棉的漏斗过滤 制备孢子悬浮， .该悬浮液与 40-50% 甘油溶液按 1:1 混合均匀后，即可。然后每个甘油管里 面加入 1.5ml 左右甘油菌悬液。 在放入 -80 度超低温保藏之前，最好在 -20 度低温下预冻 12-15 hr 后，再转入 -80 度环境下保 藏。丝状真菌还是用孢子悬液做甘油保藏好点吧！不怕麻烦的用沙土管法保藏更好。 §菌种管由传统的玻璃菌种管改为 0.5ml 带盖塑料离心管。 方法：①将塑料离心管置耐高压塑料离心管盒内并用双层报纸包好，高压蒸汽 15 磅 15min 消毒，放烤箱 80℃烤干。②在净化工作台内将脱脂牛奶洗下的浓厚菌悬液用长毛细玻璃滴 管加到塑料离心管的底部，每只 0.2ml 左右，切记不要将牛奶污染离心管口。 ③将加好菌液的离心管盒置 - 20℃冰箱预冻，预冻好后把离心管盒放置到冷冻干燥机干燥箱 内冻干。 ④冻干后在净化工作台内压好离心管盖， 不抽真空。 贴标签， 用 封口膜 封离心管口。 放- 20℃冰箱保存。 §该改良法优点有： ⑴操作过程大大简化，菌种管口不需溶封，不抽真空。⑵菌种管抗破损性极佳； ⑶菌种管体积超小。⑷成本低廉，易于商品化生产、推广。 笔者使用该改良法近七年， 本省