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优选分子生物学前沿技术教材 优选分子生物学前沿技术教材 PAGE / NUMPAGES 优选分子生物学前沿技术教材 激 光 捕 获 显 微 切 割 Laser capture microdissection (LCM) technology 是在不损坏组织构造，保存要捕捉的细胞和其四周组织 形态完好的前提下，直接从冰冻或白腊包埋组织切片中获取目标细 胞 ，往常用于从组织中精准地分别一个单调的细胞。 背景 ：机体组织包含有上百种不一样的细胞， 这些细胞各自与四周的细 胞、基质、血管、腺体、炎症细胞或免疫细胞互相粘附。在正常或发 育中的组织器官内， 细胞内信号、 相邻细胞的信号以及体液刺激作用 于特定的细胞，使这些细胞表达不一样的基因并且发生复杂的分子变 化。在病理状态下，假如同一种类的细胞发生了相同的分子改变，则 这种分子改变关于疾病的发生可能起着重点性的作用。 但是，发生相 同分子改变的细胞可能只占组织整体积的很小一部分； 同时，研究的 目标细胞常常被其余组织成分所围绕。 为了对疾病发生过程中的组织 伤害进行分子水平剖析，分别出纯净的目标细胞就显得特别必需。 1996 年，美国国立卫生院（ NIH）国家肿瘤研究所的 [2] 开发出激光 捕捉显微切割技术（ Laser capture microdissection ，LCM），次 年，美国 Arcturus Engineering 企业成功研制激光捕捉显微切割系 统，并实现商品化销售。应用该技术能够在显微镜直视下快速、正确 获取所需的单调细胞亚群， 甚至单个细胞， 进而成功解决了组织中细 胞异质性问题。 这项技术现已成为美国“肿瘤基因组解剖计划”的一 [1] 项支撑技术 。 原理 ：LCM的基来源理是经过一低能红外激光脉冲激活热塑膜——— 乙烯乙酸乙烯酯（ ethylene vinylacetate ，EVA）膜（其最大汲取峰 靠近红外激光波长） ，在直视下选择性地将目标细胞或组织碎片粘到 该膜上 [2] 。LCM系统包含倒置显微镜、固态红外激光二极管、激光控 制装置、控制显微镜载物台（固定载玻片）的操控杆、电耦合相机及 彩色显示器。用于捕捉目标细胞的热塑膜直径往常为 6mm，覆在透明 的塑料帽上，后者恰与后继实验所用的标准 0.5ml 离心管相般配。 机械臂悬挂控制覆有热塑膜的塑料帽，放到脱水组织切片上的目 标部位。显微镜直视下选择目标细胞，发射激光脉冲，瞬时升温使 EVA膜局部融化。融化的 EVA膜浸透到切片上极细小的组织空隙中， 并在几毫秒内快速凝结。 组织与膜的粘协力超出了其与载玻片间的粘 协力，进而能够选择性地转移目标细胞。激光脉冲往常连续 0.5~5.0 毫秒，并且可在整个塑料帽表面进行多次重复， 进而能够快速分别大 量的目标细胞。 将塑料帽盖在装有缓冲液的离心管上， 将所选择的细 胞转移至离心管中，进而能够分别出感兴趣的分子进行实验 [3] 。 EVA膜约 100~200μm厚，能够汲取激光产生的绝大多半能量， 在 瞬时将激光束照耀地区的温度提升到 90° C，保持数毫秒后又快速冷 却，保证了生物大分子不受伤害。 采纳低能量红外激光的同时也可避 免伤害性光化学反响的发生。 优弊端 ：LCM最明显的长处在于其快速、正确和多用途的特征。联合 组织构造特色以及所需的切割精准度，经过选择激光束的直径大小， 能够快速获取大批的目标细胞。 LCM与以显微操作仪为基础的显微切 [4] 割技术对比 ，拥有以下长处： (1) 分别细胞速度快，无需精良的操 作技术；(2) 捕捉细胞和节余组织的形态学特色均保持完满，能够较 好地控制捕捉细胞的特异性； (3) 捕捉细胞与塑料帽联合密切，减少 了组织损失的风险。对比而言，除了激光切割弹射微分别系统 [5] 以经 染色的用于存档的切片也可被成功进行显微切割。 只管 LCM应用宽泛，但关于惯例染色、固定且不加盖玻片的组织 切片，其视觉分辨率遇到很大限制。 而关于那些自己缺少必定构造特 点的复杂组织（如淋巴组织，宽泛浸润的腺癌等），要正确分别出某 一类细胞几乎是不行能的。 Fend等 [6] 经过采纳特别染色， 特别是免疫 组化方法， 使目标细胞或想要去除的细胞变得更为醒目， 进而解决了 上述难题。 应用 LCM，有时会出现没法将选择的细胞从切片上移走的状况， 出现这种结果有两种原由： (1) 细胞与热塑膜之间的粘协力不足，通 常是因为组织未完好脱水或激光的能量设置过低造成的； (2) 组织切 片与载玻片间的粘协力过强， 往常发生在显微切割干燥时间过长的冰 冻切片。针对不一样样本组织（包含免疫组化染色的组织切片），一些 研究小组分别详细报导了采纳合适的办理方法， 以达到最正确的显微切 割条件 [7] 。 应用 ：LCM较过去的显微切割技术有了打