生物化学第九章 基因重组与分子生物学技术.pptVIP

* * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * （四）PCR的主要用途 1. 目的基因的克隆 PCR技术是迅速获得一定量的目的基因以用于基因克隆的有效方法之一。主要采用的方法有：①利用特异性引物以cDNA或基因组DNA为模板，获得已知的目的基因；②利用简并引物从cDNA文库或基因组文库中获得具有同源性的DNA片段；③利用随机引物从cDNA文库或基因组文库中随机获得目的基因。 2. 基因的体外突变 采用随意设计的引物，在体外对基因进行嵌合、缺失、点突变等改造。 3.DNA的微量分析 由于PCR技术具有高度敏感性，故可用于微量DNA的分析检测。 四、 DNA序列分析技术 DNA碱基序列测定即DNA一级结构的测定，目前常用的方法为Maxam-Gilbert建立的化学裂解法和Sanger建立的双脱氧末端终止法。 双脱氧末端终止法的主要操作步骤有： 1．获得待测DNA片段的单链模板 一般采用基因工程的方法以获取一定数量的单链待测DNA模板。可将待测DNA片段与噬菌体M13DNA进行重组，然后将其导入大肠杆菌进行增殖，M13噬菌体一般以单链DNA形式透出细胞再感染新的细菌，故此可获得单链DNA模板。 2．合成寡核苷酸引物 在待测DNA片段的3-端合成一段互补的寡核苷酸引物，其顺序可为待测DNA片段3-端的一段已知顺序，也可为一段M13噬菌体的顺序。可利用DNA合成仪自动合成。 3．模板-引物杂交 将待测单链DNA模板与寡核苷酸引物混合，并在适当温度条件下进行保温处理，使引物与DNA单链模板的3-端进行杂交。 4．互补链的延长和终止 将上述杂交混合液分为四份，每份混合液中均加入DNA聚合酶，四种dNTPS，一种带放射性同位素标记的脱氧核糖核酸（如α-32P-dATP）。此外还需分别加入一种双脱氧核糖核酸（ddATP，ddGTP，ddCTP或ddTTP）。然后在适当温度条件下延伸互补链，就可得到四组分别以A、G、C、T、终止的长短不一的互补链的混合物。因在互补链合成时，如掺入的是双脱氧核糖核酸，由于缺乏3’-和2’-OH，故可导致互补链合成终止。 5．电泳分离 将四组含有长短不等的反应混合物在同一聚丙烯酰胺凝胶板上进行电泳，即可将只相差一个核苷酸的寡核苷酸链分离开。 6．放射自显影 将电泳凝胶与X光胶片压在一起，于低温下自显影数天，即可得到放射自显图谱，通过该图谱即可直接读出核苷酸的排列顺序。 分子生物学技术进展（略） 第四节 * 基因诊断和基因治疗 第五节 * 一、基因诊断二、基因治疗 Thank you * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * 基因工程基本过程及应用 第二节 * 一、目的基因的获得（分） 1．直接从染色体DNA中分离 仅适用于原核生物基因的分离，较少采用 2．人工合成 根据已知多肽链的氨基酸顺序，利用遗传密码表推定其核苷酸顺序再进行人工合成。适应于编码小分子多肽的基因。 * 3.从mRNA合成cDNA 先获得特定基因的mRNA，再通过逆转录酶催化合成其互补DNA（cDNA） ，除去RNA链后，再用DNA聚合酶合成其互补DNA链，从而得到双链DNA。这一方法通常可得到可表达的完整基因 * 逆转录酶催化的cDNA合成 4．从基因文库中筛选 将某一种基因DNA用适当的限制酶切断后，与载体DNA重组，再全部转化宿主细胞，得到含全部基因组DNA的种群，称为G文库(genomic DNA library) 将某种细胞的全部mRNA通过逆转录合成cDNA，然后转化宿主细胞，得到含全部表达基因的种群，称为C-文库(cDNA library)。C-文库具有组织细胞特异性 * 基因组文库的制作 * 5．利用PCR合成 如已知目的基因两端的序列，则可采用聚合酶链反应（polymerase chain reaction, PCR）技术，在体外合成目的基因。但此法可能会造成克隆的目的基因碱基序列的改变。 * 二、载体和目的基因的切断（切） 通常采用限制性核酸内切酶(restriction endonuclease)，简称限制酶，分别对载体DNA和目的基因进行切断，以便于重组。 由限制酶切断后的末端可形成平端、3-突出黏性末端和5-突出黏性末端三种情况。形成黏性末端(cohesive end)者较有利于载体DNA和目的基因的重组。 * 三、载体和目的基因的重组（接） 即将带有切口的载体与所获得的目的基因连接起来，得到重新组合后的DNA分子。 * （一）黏性末端连接法 （二）人工接尾法 即同聚物加尾连接