生物化学试验：Folin-酚试剂法（Lowry法）测定蛋白质浓度.pptVIP

Folin-酚试剂法（Lowry法）测定蛋白质浓度 * 成绩 生物化学实验要求 平时成绩（30%） 期末成绩（70% ） 实验报告、考勤（10%） 实验考试（10%）， 1h实验测试 科研设计标书（10%） * 常用仪器设备的使用 刻度吸管（擦、慢、吹） ① 选择 ② 拿取 2. 试管 3. 分光光度计 * 分光光度法（specrophotometry） I0 入射光 I 出射光 透光度（T）：I/I0 定义：分光光度法是通过测定被测物质在特定波长处或一定波长范围内光的吸收度，对该物质进行定性和定量分析的方法。 * 分光光度法（specrophotometry） Lambert定律 lg I0/I=K1L K1是常数，L为溶液的厚度(光径)。 2. Beer定律 lg I0/I=K2C K2是常数，C为溶液的浓度。 3. Lambert-Beer定律 A=KCL A为吸光度(光密度、消光度)，K为常数(消光系数) 。 * 分光光度法（specrophotometry）的应用 A标=KC标L， A测=KC测L * 一、实验目的 1. 掌握Folin-酚法测定蛋白质含量的原理及操作步骤。 2. 掌握分光光度计的操作。 * 临床意义 血清总蛋白增高 血液浓缩：腹泻 合成增加：多发性骨髓瘤 2.血清总蛋白降低 血液稀释 摄入量不足：营养不良 合成障碍：肝脏疾病 蛋白质丢失：肾病综合症 * 二、实验原理 蛋白质浓度测定 微量凯氏定氮法 双缩脲法 Folin-酚试剂法 考马斯亮蓝染色法 紫外吸收法 常用方法： ① 考马斯亮蓝法(有色)： 10~1000 ug/ml ② 紫外分光光度计法(无色)：100~500 ug/ml Folin-酚试剂法：不常用 显色反应 25 ~ 250 ug/ml * 蛋白质 碱性铜试剂 铜-蛋白质络合物（双缩脲反应） 试剂甲 -CO-NH- 紫红色(mg级) 铜-蛋白质络合物 磷钼酸-磷钨酸 磷钼蓝 + 磷钨蓝 试剂乙 深蓝色 (ug级) (Folin试剂) 二、实验原理 络合物中的酪氨酸和色氨酸残基上的酚基使磷钼酸–磷钨酸还原，生成蓝色物质。 * 优点：此方法操作简便，灵敏度比双缩脲法高100倍，定量范围为每25～250μg/ml蛋白质，是测定蛋白质含量的常用方法。 缺点：Folin试剂显色反应由酪氨酸、色氨酸和半胱氨酸引起，因此样品中若含有酚类、柠檬酸和巯基化合物均有干扰作用。此外，不同蛋白质因酪氨酸、色氨酸含量不同而使显色强度稍有不同。 实验优缺点 * 三、实验步骤 待测样品稀释（血清Pr浓度过高mg级）： 0.1ml 血清，置于50ml 容量瓶，加生理盐水至离刻度1-2cm处，以胶头滴管补充至刻度， 倒置摇匀。此为血清待测液样品。 * 管号 空白 标准 待测 蛋白质标准溶液 （250μg/ml） - 0.4 _ 待测样品/ml - - 1.0 生理盐水/ml 1.0 0.6 - 碱性铜/ml 5.0 5.0 5.0 混合均匀，室温10min 酚试剂/ml 0.5 0.5 0.5 各管充分混合均匀，置于室温放置30min, 以空白管调零，波长650nm 比色，分别读取各管吸光度值。取三次测定的平均值，根据公式（P156）计算出待测蛋白浓度。 2. 取玻璃管3支，按下表操作： * 3. 722型分光光度计的使用 1. 开机预热10分钟 2. 调波长 3. 空白、标准与待测液体加入比色杯 4. 开盖调“0”，关盖调“100”------T 5. 转至A档，测吸光度------A 6. 记录，重复测三次 * 标准管 待测管 实验步骤 空白管 原始数据 A标，A测（3次测量结果的平均值） 计算结果