一种新型冠状病毒核酸检测试剂盒发明专利.docxVIP

一种新型冠状病毒核酸检测试剂盒 技术领域： 本发明涉及新型冠状病毒(SARS-CoV-2)核酸的分子检测技术，具体涉及病毒RNA的等温扩增和CRISPR/Cas蛋白检测的分子检测技术及其相应的检测试剂盒。本发明实现了在单管中一步法对新型冠状病毒(SARS-CoV-2)RNA的恒温扩增和CRISPR/Cas13a检测。 背景技术： 冠状病毒(Coronavirus)是一类可以在动物和人之间传播的人畜共患单链正义RNA病毒。目前已经发现有7种冠状病毒可以感染人类，引起人类的呼吸道感染疾病。人类冠状病毒229E，人类冠状病毒OC43，人类冠状病毒NL63和人类冠状病毒HKU1这四种冠状病毒可以引起症状较轻，类似普通感冒症状的疾病；而2003年爆发的SARS严重急性呼吸综合征，2012年爆发的MERS中东呼吸综合征和目前全球爆发COVID-19新型冠状病毒肺炎分别是由其冠状病毒SARS-CoV，MERS-CoV，SARS-CoV-2引起的三种较严重传染性肺部疾病。 新型冠状病毒SARS-CoV-2是在人类中发现的一种新的冠状病毒，新型冠状病毒SARS-CoV-2属于β属型冠状病毒，有包膜，颗粒呈圆形或椭圆形，常为多形性，直径约为60-140nm。其基因组特征与SARS-CoV和MERS-CoV有明显区别。目前认为新型冠状病毒SARS-CoV-2的传播途径主要是由呼吸道的分泌物的进行飞沫传播，或者是接触到患者的病毒而引起感染。人群普遍易感，潜伏期一般为不超过14天，多为3-7天。多数以发热、乏力、干咳为主要表现。少数患者在感染新型冠状病毒后可无明显临床症状，目前认为无症状患者也具有传播疾病的能力。少数患者伴有鼻塞、流涕、咽痛和腹泻等症状。重型病例多在一周后出现呼吸困难和/低氧血症，严重者快速进展为急性呼吸窘迫征、脓毒症休克、难以纠正的代谢性酸中毒和出凝血功能障碍。 目前临床上对新型冠状病毒的感染的诊断，主要是依据临床特征表现、肺部的影像学资料和实验室的诊断结果相结合方法来判断，而其中实验室的新型冠状病毒的核酸的检测结果是目前最终确诊新型冠状病毒的感染的最明确的标准。目前实验室的检测新型冠状病毒的方法主要分为新型冠状病毒核酸的检测和新型冠状病毒抗体的检测即血清学检测两大类。 新型冠状病毒血清学的检测目前主要是基于常用的胶体金法、酶联免疫法和化学发光法检测新型冠状病毒特异性IgM抗体和IgG抗体，虽然IgM抗体在早期便可以产生，但是其新型冠状病毒感染早期诊断的灵敏度较低，新型冠状病毒IgG抗体产生后，可以较长时存在于血清中，在康复的患者中依旧可以检测到。目前新型冠状病毒血清学的检测其灵敏度和特异性都比较有限，不能作为新型冠状病毒感染确诊和排除的唯一依据，不适用于人群的筛查，可作为新型冠状病毒核酸检测补充检测手段。 新型冠状病毒核酸检测，目前主要检测方法有：1)荧光定量PCR，2)等温扩增检测法，3)病毒基因测序方法。荧光定量PCR是利用一对特异性引物在耐高温DNA聚合酶实现靶标核酸的分子的扩增，并在荧光探针或者荧光染料结合下，产生产生荧光报告信号的方法。在检测RNA靶标时，该方法中还应加入逆转酶，进行逆转录反应将RNA转变为DNA。荧光定量PCR法是目前分子诊断中最常用的方法，也是分子诊断中认可的金标准方法。但是荧光定量PCR方法同样存在很多缺点，该方法实施过程中需要昂贵且精密的荧光定量PCR仪器，需要较为严格的PCR实验室环境，对实验人员的要求也比较高，虽然荧光定量PCR是闭管反应检测的，但是其在实施过程中产生污染的风险一直存在，一旦发生后果严重，且难以消除。目前新型冠状病毒核酸的检测的主要方法就是荧光定量PCR-探针法。 与荧光定量PCR方法需要的循环的变温过程相比，近些年来分子诊断技术同样发展了许多等温扩增检测方法，例如，环介导等温扩增技术(LAMP)，重组酶聚合酶扩增技术(RPA)核酸序列依赖的扩增技术(NASBA/TMA)，LAMP，RPA和NASBA/TMA这些等温扩增技术完成扩增后往往都是需要结合特异性的荧光报告探针来完成检测信号的报告。 LAMP技术是利用4对引物和具链置换活性的DNA聚合酶在65℃左右恒温的条件下，实现DNA靶标的扩增；LAMP法检测的低浓度核酸的灵敏度往往不足，特别是在弱信号情况下，信号分辨率和检测特异性也很难保证。如果LAMP法扩增后需要开盖检测的话，污染和假阳性也很难控制。重组酶聚合酶扩增技术RPA是利用重组酶，DNA聚合和单链结合蛋白SSB在ATP存在的情况下利用一对引物实现靶标DNA的扩增，RPA技术往往在37-42℃的恒温反应下，就可以达到最佳的扩增条件，在室温下也可以直接反应，RPA的技术的优势在于反应的时间短，一般在15分钟内就可以完成扩增反应。但是RPA的缺点也很明显，RPA的扩增反应系统