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HRM操作流程纲领 HRM操作流程纲领 HRM操作流程纲领 可编写可更正 HRM的应用 2021-10-22 10:05 阅读 ( 378) 谈论 ( 0) 高分辨率熔解曲线解析技术〔 High Resolution Melting 〕，简称 HRM ，是近来几年来流行 的一种检测基因突变、 进行基因分型和 SNP检测的新工具， 可以迅速的检测出核酸片段中单 碱基的突变。 HRM技术因其速度快，操作简略，高通量，矫捷性特异性高，对样品无污染等优点而被迅速的应用在生命科学、医学、农学、畜牧业等领域的研究工作中。 1． 原理 HRM 技术主若是基于核酸分子物理性质的不相同。 不相同核酸分子的片段长短、 GC 含量、 GC 分布等是不相同的， 因此任何双链 DNA 分子在加热变性时都会有自己熔解曲线的形状和地址。 HRM 技术的根根源理就是依照熔解曲线的不相同来对样品来进行区分。 以二倍体细胞为例， 当纯和子样品经过 PCR 扩增，经过变性复性后， 依旧是纯合子， 如图一 A 。而杂合子 PCR 扩增完， 经过变性复性后，样品中会形成局部的含有非沃森 - 克里克配对的双链分子存在。 如图一 B 所示，杂合子样品扩增后， 经变性复性，会有非配对碱基的形成，而纯合 子样品没有。这样， 杂合子样品相对纯合子样品来说，双链不够牢固， 表现在解链温度上就会有渺小的差异。 若是采用高分辨率的仪器进行检测， 并用特地的软件进行解析， 渺小的差异就会被检测出来，从而成功的精选出纯合子与杂合子。 以下列图是杂合子样品熔解曲线的的表示图： 1 可编写可更正 以二倍体细胞为例，杂合子扩增后经过变性复性会形成二种同源双链和两种异源双 链的混杂物， 在熔解过程中四种链会形成一条独到的溶解曲线， 从而与纯合子的熔解曲线区 分出来。 以下列图是采用 Lightscanner 仪器对纯合子， 杂合子， 双杂合样品的解析结果。 2 可编写可更正 图三 . 采用 Lightscanner 系统对标准样品的解析。灰色的曲线代表的是纯合子样品，红 色的曲线代表的是杂合子样品， 蓝色的曲线代表的是双杂合样品， 经过 Lightscanner 系统的解析，三种样品被明显的分为了三类，表现出了极高的矫捷性和正确性。 应用 HRM技术可以用于以下两方面：突变筛查和基因分型。下面将详细的讲解这两种方法。 突变筛查 所谓突变筛查指的是搜寻目的片段中的未知 SNP位点。由于杂合子与纯合子的熔解温度不 同，依照产生的曲线形状的不相同判断样品可能存在 SNP位点。详细以以下列图所示： 此方法的要求是： a：要求目的片段 150-400bp 。 b：在 PCR反响从前参加 LC Green 。 c：要求模板的量要均一，引物的特异性要好。 d：反响系统为 10ul ， LC Green 的参加量为 1ul 。 e：在 PCR反响从前应参加矿物油 25ul 。 3 可编写可更正 介绍反响系统下： 操作步骤以下： ⑴． 配制 PCR缓冲液。 ⑵． 进行梯度实验。梯度实验分两步：第一步不加 LC Green，确定引物可否能用。第二步 加 LC Green ，确定加染料后的退火温度。一般加染料此后的退火温度会高于不加染料的 5℃左右〔取决于引物的特异性〕。 ⑶．用优化好的 PCR条件扩增模板。介绍反响程序为： ⑷．双击 Lightscanner 图标，翻开文件。点击“ RUN〞，设置扫描程序。将反响此后的 96 孔板放入 LS96 中进行扫描。 等待温度升到待机温度， 将 96 孔板插入到机器内， 注意有切角 的一端先插入，待门关好。点击“ Start Run〞，弹出一个窗口，用来储蓄文件。 软件对数 据进行收集。 4 可编写可更正 ⑸． 解析结果。翻开 LightScanner 软件：在桌面上点击 LightScanner 的图标。翻开要分 析的数据： 点击“ Scanning〞后会弹出一个窗口，尔后选纲要解析的数据，翻开。 对数据进行分组 〔如 果不需要分组的话直接进入下一步〕。点击软件左上角的“ Subsets 〞，尔后点击软件中部 的“ New Subset〞按钮，此时软件自动记录为第一组。在 Sample Selection 里选纲要分入 到第一组的样本，尔后点击软件页面下方的“ Add Marked to Subsets 〞，此时，第一组分 组达成。若是还需要分组，再点击“ New Subset〞按钮，此时软件自动记录为第二组，选择 要分入第二组的样本，点击“ Add Marked to Subsets 〞，此时，第二组分组达成。若是需 要更多分组， 重复以上操作直至分组达成。 对样品进行命名： 点击软件上方的“ samples〞， 软件右侧显示出一个表