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DNA琼脂糖凝胶电泳实验原理和方法步骤 DNA琼脂糖凝胶电泳实验原理和方法步骤 DNA琼脂糖凝胶电泳实验原理和方法步骤 DNA的琼脂糖凝胶电泳实验原理和方法步 骤 脂糖凝胶 泳是用于分别、 定和提 DNA 片段的 准方法。 脂糖是从 脂中提取的一种多糖，具 水性，但不 荷，是一种很好的 泳支持物。 DNA 在碱性条件下〔pH8 0 的 冲液〕 荷，在 中通 凝胶介 向正极移 ，不同样 DNA 分子片段由于分子和构型不同样，在 中的泳 速率液不同样。溴化乙 〔 EB〕可嵌入 DNA 分子碱基 形成 光 合物， 紫外 照射后，可分出不同样的区 ，到达分别、 定分子量， 重 子的目的。 ? 一、实验目的 学习和掌握琼脂糖电泳法判断 DNA 的原理和方法。 二、实验原理 琼脂糖凝胶电泳是用于分别、判断和提纯 DNA 片段的标准方法。琼脂糖是从琼脂中提取的 一种多糖，具亲水性，但不带电荷，是一种很好的电泳支持物。 DNA 在碱性条件下〔的缓 冲液〕带负电荷，在电场中经过凝胶介质向正极搬动，不同样 DNA 分子片段由于分子和构型 不同样，在电场中的泳动速率液不同样。溴化乙锭〔 EB〕可嵌入 DNA 分子碱基对间形成荧光络 合物，经紫外线照射后，可分出不同样的区带，到达分别、判断分子量，精选重组子的目的。 三、实验资料 实验 14 提取的 DNA 样品， 四、器具及药品 电泳仪， 电泳槽， 紫外透射反射仪， 恒温 水浴 锅，微波炉， 微量进样器， 三羟甲基氨基甲烷，盐酸，醋酸钠， EDTA，琼脂糖，溴酚蓝，溴化乙锭。 五、实验步骤 1、安装电泳槽 将有机玻璃的电泳凝胶床洗净， 晾干，用胶带将两端的张口封好， 放在水平的工作台上，插上样品梳。 2、琼脂糖凝胶的制备 称取琼脂糖溶解在电泳缓冲液中，〔按的琼脂糖含量， 1-25kb 大小的 DNA 用  1%的凝胶， 20-100kb 的 DNA 用%的凝胶， 200-2000bp 的 DNA 用 %的凝胶〕置微波炉或沸  水浴 中加热至 完好溶化〔不要加热至沸腾〕，取出摇匀。 3、灌胶 将冷却到  60℃的琼脂糖溶液轻轻倒入电泳槽水平板上。 4、待琼脂糖胶凝固后，在电泳槽内参加电泳缓冲液，尔后拔出梳子。 5、加样 将 DNA 样品与加样缓冲液〔 loading buffer 〕按 4： 1 混匀后，用微量 移液器 将混杂液加到样品槽中，每槽加 10-20μl，记录样品的点样次序和加样量。 6、电泳 安装好电极导线，点样孔一端接负极，另一端接正极，翻开电源，调电压至 3-5V/cm ，电泳 1-3hr ，当溴酚蓝移到距凝胶前沿 1-2cm 时，停止电泳。 7、染色和观察 取出凝胶，放在含有溴化乙锭的染色液中染色 30min，即可在 254nm 的紫外灯下观察，有橙红色荧光条带的地址，即为 DNA 条带，或在紫外灯下照相记录电泳图谱。溴化乙锭是致 癌剂，操作时要小心，必定戴手套。 附： 5 × TBE〔tris- 硼酸及 EDTA〕缓冲液的配制 (1000ml) ： Tris 54g，硼酸， LEDTA20ml，将 pH 调到，定容至 1000ml ，4℃ 冰箱保存，用时稀释 10 倍。 ⑵加样缓冲液的配制： %溴酚蓝， 40%〔 W/V 〕蔗糖水溶液， 4℃ 冰箱保存。 ⑶溴化乙锭的配制： 称取溴化乙锭，溶于 10ml 水，配成终浓度为 10mg/ml 的母液， 4℃ 冰箱保存。染色时，吸 取 μl的母液，参加 250ml 的水中，使其终浓度为 μg/ml，混杂均匀。 ⑷100 倍 TE 缓冲液的配制： 1mol/L Tris-HCl〔〕， 100mmol/LEDTA 称取，，先用 800ml 双蒸水，加热搅拌溶解后，再用盐酸调 尔后定容至 1000ml 。 ⑸100 倍电泳 缓冲液 的配制：  pH 至〔大体参加盐酸  20ml 〕， 4mol/LTris-HCl〔 pH8..0〕， 2mol/L 醋酸钠 ， 200mmol/L EDTA 称取，无水乙酸钠，，先用 冰乙酸 50ml〕，尔后定容至  400ml 双蒸水加热搅拌溶解后，再用冰乙酸调 500ml 。用时稀释 100 倍。  pH 至〔大体参加