DNA的粗提取与鉴定.pptVIP

2021/9/12 * 2、实验原理 ① DNA在NaCl溶液中的溶解度,是随着NaCl的浓度的变化而改变的。当NaCl的物质的量浓度为0.14 mol／L时,DNA的溶解度最低。利用这一原理,可以使溶解在NaCl溶液中的DNA析出。 ② DNA不溶于酒精溶液,但是细胞中的某些蛋白质可以溶于酒精溶液。利用这一原理,可以进一步提取出含杂质较少的DNA。 ③ DNA遇二苯胺（沸水浴）会染成蓝色,因此,二苯胺可以作为鉴定DNA的试剂。 2021/9/12 * 3、实验材料和用具: 鸡血细胞液（5~10ml）;体积分数为95%的冷酒精溶液（实验前置于冰箱内冷却24h）;蒸馏水;质量浓度为0．１g/ml的柠檬酸纳溶液;务质量的浓度分别为2mol/L和0．015mol/L的氯化纳溶液;二苯胺试剂。铁架台;铁环;镊子;三角架;酒精灯;石棉网;载玻片;玻璃棒;滤纸;滴管;量筒（100ml,一个）;烧杯;（100ml,一个,50ml、500ml各二个）;试管（20ml,二个）;漏斗;试管夹;纱布。 2021/9/12 * 4、课前准备鸡血细胞液 取质量浓度为0．1g/ml的柠檬酸纳溶液（抗凝剂）100ml,置于500ml烧杯中。注入新鲜的鸡血（约180ml）,同时用玻璃棒搅拌,使血液与柠檬酸纳溶液充分混合,以免凝血。将烧杯中的血液置于冰箱内,精置一天,使血细胞自行沉淀。（也可以将血液倒入离心管内,用1000r/min（转每分）的离心机离心2min,血细胞沉淀于离心管底部。实验时。用吸管除去离心管上部的澄清液,就可以得到鸡血细胞液。） ①过程 2021/9/12 * ②柠檬酸钠作用 防止血液凝固 ③作用机理 柠檬酸钠能与血浆中的Ca2+发生反应,生成柠檬酸钙络合物,血浆中游离的Ca2+大大减少,血液就不会凝固 鸡血细胞破碎以后释放出的DNA,容易被玻璃容器吸附,所以在提取过程中为了减少DNA的损失,最好使用塑料的烧杯和试管盛放鸡血细胞液 ④注意事项 2021/9/12 * 讨论:提取鸡血中的DNA时,为什么除去血液中的上清液? 答:血液分为两部分,一部分是血浆,一部分是血细胞,离心后除去的上清液是血浆 5、方法步骤 将制备好的鸡血细胞液5 mL～10mL,注入到50 mL烧杯中。向烧杯中加入蒸馏水20 mL,同时用玻璃棒充分搅拌5 min,使血细胞加速破裂。然后,用放有纱布的漏斗将血细胞液过滤至500mL。取其滤液。 ①提取鸡血细胞的细胞核物质 2021/9/12 * 2021/9/12 * 讨论: 答:让细胞内浓度大于周围溶液的浓度,细胞会吸水以至胀破 （1）为什么要加入蒸馏水?加入蒸馏水后细胞会有什么变化? （2）用玻璃棒搅拌有什么意义? 答:用玻璃棒搅拌可以加速血细胞和细胞核的破裂。注意应沿一个方向快速搅拌,但也不能太快太猛,防止打碎DNA （3）滤去的是什么物质?得到的是什么? 答:过滤将滤去的是细胞膜和核膜等物质;得到的是与蛋白质等物质结合在一起的DNA 2021/9/12 * ②溶解细胞核内的DNA 将氯化钠的物质的量浓度为 2 mol的溶40mL加入到滤液中,并用玻璃棒沿一个方向搅拌1min,使其混合均匀,这时DNA在溶液中呈溶解状态 沿烧杯内壁缓缓加入蒸馏水,同时用玻璃棒不停地轻轻搅拌,这时烧杯中有丝状物出现,注意观察丝状物呈什么颜色。继续加入蒸馏水,溶液中出现的粘稠物会越来越多。当粘稠物不再增加时停止加入蒸馏水（这时溶液中氯化钠的物质的量浓度相当于0.14 mol／L） ③析出含DNA的粘稠物 2021/9/12 * 2021/9/12 * 讨论:加入蒸馏水的目的? 降低NaCl溶液浓度到使DNA溶解度最低点,使DNA从NaCl溶液中析出 将溶液中的DNA与其他杂质分离,这一步骤是实验成败的关键。实验中应该缓慢贴壁加入蒸馏水,并轻轻地沿一个方向不停地均匀搅拌,以利于DNA分子的附着和缠绕 注意事项: 2021/9/12 * ④滤取含DNA的粘稠物 用放有多层纱布的漏斗,过滤步骤3中的溶液至 500mL的烧杯中,含 DNA的粘稠物被留在纱布上 ⑤将DNA的粘稠物再溶解 取 1个 50 mL烧杯,向烧杯内注入氯化钠的物质的量浓度为 2 mol／L的溶液 20mL。用钝头镊子将纱布上的粘稠物夹至氯化钠溶液中,用玻璃择不停地搅拌,使粘稠物尽可能多地溶解于溶液中 2021/9/12 * 2021/9/12 * ⑥过滤含有DNA的氯化钠溶液 取1个100 mL烧杯,用放有两层纱布的漏斗过滤步骤5中的溶液。取其滤液,DNA溶于滤液中 ⑦提取含杂质较少的DNA 在上述滤过的溶液中,加入冷却的、酒精的体积分数为 95％的溶液 50mL（使用冷却的酒精,对DNA的凝集效果较佳）,并用玻璃棒搅拌,溶液中会出现含杂质较少的丝状物。用玻璃棒将丝状物卷