基因多态性检测试剂盒研究资料.pdfVIP

IL28B基因多态性检测试剂盒(基因芯片法) 研究资料摘要 1.引言 丙型肝炎病毒(HCV)是单股正链RNA包膜病毒，属黄病毒科丙型肝炎病 毒属,可分为6个主要的基因型。在全世界范围内的感染率大约有22%,其中 70%〜80% 的感染者处于慢性化感染状态,并可进一步发展成肝纤维化、肝癌，是威 胁人类健康的 要疾病之一。目前，治疗慢性丙型肝炎国内外推荐的治疗方案为 长效干扰素(PeglFN)与利巴韦林(RBV)联合治疗，但获得持续病毒学应劄SVR)的 患者只有54%〜63%,。研究发现病毒(HCV基因型、治疗前病毒载量)和宿主因素 (人种、性别、年龄、单核甘酸多态性等)可能影响患者的抗病毒疗效。研究显示, 宿主 (人)位于染色体19的IL28B基因上游单核昔酸多态性位点(rsl2979860和 rs8099917)与患者聚乙二醇干扰素联合利巴韦林治疗后的病毒清除有显著相关性 ［ 1718］； 研究发现携带rsl2979860 CC型基因的HCV感染者，其发生病毒自发清除的 可能性是携带T等位基因型感染者的2倍以上 ［比值比(0R)=2.12) 进一步的分析 还证实，rsl2979860 CC型基因携带者血清IL28B表达水平显著高于T等位基因 型携带者。这提示携带IL28B T等位基因能够引起IL28B表达水平的降低，继而 可能降低HCV感染后机体的抗病毒应答能力。rs8099917对HCV病毒的自发清 除有预测作用，G等位基因携带者比TT基因型HCV感染者更难于发生病毒的 自发清除。鉴于个体化差异对丙型肝炎患者的抗病毒疗效存在很大影响而干扰素 的疗效欠理想、价格昂贵、副作用多的缺陷等原因，预测宿主IL28B基因将为患 者的个体化治疗提供更加科学、准确、合理的临床指导。 基因芯片技术是近几年发展起来的新技术，它通过借鉴电子计算机机芯片阵 列寻址原理，利用核酸分子杂交和化学发光技术，使检测结果具有灵敏度高、所 需样本微量和操作简便等特点，是一种先进的SSO法。 20世纪80年代末到90年代初，美国Affymetrix公司率先开展了这方面的研 究。1991年，该公司生产了世界上第一块寡核昔酸基因芯片。同时，随着荧光 标记、激光共聚焦扫描和计算机分析等技术发展，1995年在美国Stanf rd大学 诞生了第一块以玻璃为载体的微矩阵基因芯片，标志着基因芯片技术步入了广泛 研究和应用的时期。 2. 研究目的 开发建立IL28B基因多态性检测试剂盒。 3. 研究设计 本试剂盒的主要技术原理如下图： 本试剂盒所采用的PCR体系是我们选用改良型的通用模板，经一系列的优 化处理后建立的直用型PCR体系，可以实现对IL28B基因特异性目的片段的有 效扩增。进行检测时，先把待测样本用样本处理液处理后提取DNA,经PCR 扩增并变性后得到标记的目的寡核甘酸链，在特定条件下与含有捕获探针的功能 化基因芯片进行杂交。当反应体系中含有目的核酸时，捕获探针就会通过互补序 列与 目的核酸结合，随后HRP -TMB扩增显色系统就会启动，此时生物传感器 功能化涂层就会发生光学变化，呈现蓝色，即阳性结果；否则，依然保持芯片片 基原有底色，即阴性结果，从而实现对结果的肉眼判读。 本试剂盒IL28B基因芯片探针矩阵设计如下： • • •• • 9860-C 9860-T 质控探针 • • •• • 9917-T 9917-G 质控探针 • • •• • Neg P s. 质控探针 本试剂盒实验流程图如下: 本试剂盒工艺流程图如下: 4.1灵敏度 从中山大学第五附属医院收集普通人群或疑似丙型肝炎病毒或确诊患有丙 型肝炎病毒的全血样本，经临床定量白细胞数分为40000, 4000, 400/ml,每个 级别各取5份进行独立定量检测后混合均匀作为一份标本，分别编号为 QL 1-QL3,我们选用这一套标本梯度作为检测灵敏度的评估指标。每批试剂对己 准备好的检测下限标本每个样本做100次 复测定。100次 复的阳性符合率大 于95% 的最小病原