食品安全检验技术实验参考材料.docVIP

如有帮助，欢迎下载支持。 实验一 蔬菜中有机磷和氨基甲酸酯类农药的生物化学测定 一、实验目的 通过实验了解和掌握蔬菜中农药残留量的生物化学测定的原理和方法，比较两种常见的生物化学测定法，即速测卡法和酶抑制率法的异同。 二、实验原理 生物化学测定方法根据其检测手段又可分为速测卡法和酶抑制率法 （分光光度法）。速测 卡法的测定原理是根据胆碱酯酶可催化靛酚乙酸酯（红色）水解为乙酸和靛酚（蓝色） ，有机 磷或氨基甲酸酯类农药对胆碱酯酶有抑制作用，使催化、水解、变色的过程发生改变，由此 可判断出样品中是否含有高剂量的有机磷或氨基甲酸酯类农药。 酶抑制率法的原理是在一定条件下， 有机磷或氨基甲酸酯类农药对胆碱酯酶有抑制作用， 其抑制率与农药的浓度呈正相关。正常情况下酶催化乙酰胆碱水解生成胆碱，胆碱在显色剂 的作用下产生黄色物质，该黄色在 412nm 处有特征吸收峰，用可见分光光度计或农药残毒快 速检测仪进行测定。 三、试剂及仪器 、仪器 常用天平、农药残毒快速检测仪、台式恒温培养箱、微型混合器。 、试剂 农残速测卡：固化有胆碱酯酶和靛酚乙酸酯试剂的纸片； pH8.0 缓冲溶液：取 11.9mg 无水磷酸氢二钾与 3.2mg 磷酸二氢钾，用 1000mL 蒸馏水溶 解； 显色剂：取 160mg 二硫代二硝基苯酸（ DTNB ）和 15.6mg 碳酸氢钠，用 20mL 缓冲溶液 溶解，在 4℃冰箱中保存； 底物：取 25.0mg 硫代乙酰胆碱 8.0mL 蒸馏水溶解，摇匀后置于 4℃冰箱中保存，保存期 不超过一周； 乙酰胆碱酯酶：根据酶的活性情况，用缓冲溶液溶解，但吸光度值应控制在 0.3 以上。 可选用以上试剂制备的试剂盒（含缓冲液、显色剂、底物、乙酰胆碱酯酶，不同厂家生产的试剂盒具体试验操作不完全相同） 。 四、测定步骤 、速测卡法（纸片法） 滴 2~3 滴洗脱液在菜叶正面近叶尖部分，用另一片菜叶滴液处轻轻摩擦。 ② 取一片速测卡，将菜叶上洗出的水滴 1 滴在白色药片上，静置 10min，保持药片润湿。 ③ 将速测卡对折，用手捏 3min。 ④ 打开速测卡，白色药片变蓝色为正常反应，不变蓝或显淡蓝色说明有过量有机磷或氨基甲酸酯类农药残留。每批同时做一片无农药对照。 、酶抑制率法 取 2g 切碎样本，置于提取瓶内，加入20mL 提取试剂，震荡 1~2min ；倒出上清液，静 置 3~5min 。于平底小试管中加入 100μL 酶液、3mL 样品提取液、 100μL 显色剂，在 37~38℃ 下培养 15min。 于待测的小试管内加入 100μL 底物，倒入比色杯内， 进行仪器测定。 同时做对照组试验。 （注：不同试剂盒的添加量不完全相同，具体按说明书操作。） 五、结果计算和判定 1 如有帮助，欢迎下载支持。 、速测卡法 速测卡检测结果以酶被有机磷或氨基甲酸酯类农药抑制（阳性）和未抑制（阴性）来表 示。强阳性结果：速测卡白色药片不变色，说明农药残留量高；弱阳性结果：速测卡白色药片显浅蓝色，说明农药残留量相对较低；阴性结果：速测卡白色药片显天蓝色或与空白对照卡相同。 表 1-1 所示为速测卡法对我国常见使用的一些有机磷和氨基甲酸酯类农药的最低检出限。 表 1-1 速测卡对几种农药的最低检测限（ mg/kg） 农 药 检测限 农 药 检测限 农 药 检测限 甲胺磷 1.7 乙酰甲胺磷 3.5 甲萘威（西维因） 2.5 敌敌畏 0.3 丁硫克百威 1.0 克百威（呋喃丹） 0.1 氧化乐果 2.3 马拉硫磷 2.0 久效磷 2.5 乐果 1.3 水胺硫磷 3.1 敌百虫 0.5 对硫磷 1.7 使用速测卡法检出蔬菜样品为农药阳性时，需用气相色谱或质谱法对阳性试样进行进一步的实验来确定是哪种农药以及其确切含量。 2 、酶抑制率法 抑制率 Ac At 100% Ac 式中： Ac——对照管溶液反应 3 min 吸光度的变化值； At——样品管溶液反应 3 min 吸光度的变化值。 当样品提取液对酶的抑制率＜ 50%时，表示样品农药残留检测合格； 若抑制率≥ 50%，表示样品中可能含有高浓度的有机磷或氨基甲酸酯类农药，则实验需要重复两次以上。 表 1-2 所示为酶抑制率法对部分农药的最低检测限。 表 1-2 分光光度法对几种农药的最低检测限（mg/kg ） 农 药 检测限 农 药 检测限 农 药 检测限 甲胺磷 1.5 甲基异硫磷 5.0 灭多威 0.1 敌敌畏 0.01 克百威 0.002 敌百虫 0.2 氧化乐果 0.8 马拉硫磷 4.0 对硫磷 0.1 乐果 1.0 辛硫磷 0.3 六、注意事项 1、速测卡法检测中，当温度低于 37℃时，酶反应的速度随之放慢，药片加液后放置反应的 时间应相对延长。延长时