生物化学重组dna技术修改.pptxVIP

;2;DNA重组（DNA recombination）是指不同DNA分子断裂和连接而产生DNA片段的交换并重新组合形成新DNA分子的过程。 重组DNA技术（recombinant DNA technology）是指在体外将两个或两个以上DNA分子重新组合并在适当细胞中增殖形成新DNA分子的过程。 ;4;第一节自然界DNA重组和基因转移DNA Recombination and Gene Transfer in Nature;6;2020/9/30;Holliday模型的4个关键步骤： ;片段重组体 （见模型图左边产物）： 切开的链与原来断裂的是同一条链，重组 体含有一段异源双链区，其两侧来自同一亲本DNA。;参与细菌DNA同源重组的酶有数十种，其中最关键的是RecA蛋白、RecBCD复合物和RuvC蛋白。 RecBCD复合物具有三种酶活性，即依赖于ATP的核酸外切酶活性、可被ATP增强的核酸内切酶活性以及需要ATP的解螺旋酶活性。 RecA蛋白可结合单链DNA（ssDNA），形成RecA-ssDNA复合物。 RuvC有内切酶活性，能专一性识别Holliday连接点，并有选择地切开同源重组体的中间体。 ;; DNA 连接酶;13; （一）λ噬菌体; 细菌的attl位点称为att B，其序列的成份是BOB′，在噬菌体上的att位点，称为att P，含有POP′。“O”序列是att B和att P共有的，被称为核心（core）序列，长15bp，重组就发生在此序列上。两侧序列B，B′和P，P′是作为臂（arms）；臂序列各不相同 在att位点的整合和切离并不涉及反应序列的同源部分。整合需识别att P和att B；而切离时需要att L和att R。 整合和切离这两个反应所依赖的蛋白不完全相同。整合（att B ×att P）反应需要噬菌体int基因的产物和宿主的整合因子（integration host factor,IHF）。切离（att L × att R）反应需要噬菌体Xis基因的产物以及Int和IHF蛋白的参与。两个反应都需要Int和IHF，而Xis在控制方向上起到重要的作用。它是切离所需要的，对整合起抑制作用。;细菌的特异位点重组;hix为反向重复序列，它们之间的H片段可在Hin控制下进行特异位点重组(倒位)。H片段上有两个启动子P，其一驱动hin基因表达，另一正向时驱动H2和rH1基因表达，反向(倒位)时H2和rH1不表达。rH1为H1的阻遏蛋白基因。;（三）免疫球蛋白基因的重排;重链(IgH)基因的V-D-J重排和轻链(IgL)基因的V-J重排均发生在特异位点上。在V片段的下游，J片段的上游以及D片段的两侧均存在保守的重组信号序列(recombination signal sequence, RSS)。此重排的重组酶基因rag (recombination activating gene)共有两个，分别产生蛋白质RAG1和RAG2。 ;免疫球蛋白基因重排过程;21;转座子的概念及发现;转座子是基因组的正常组成成分，不以独立的形式存在（如噬菌体或质粒DNA）。转座的发生不依赖于转座子和靶位点之间任何的序列同源性，在基因组内由一个部位直接转移到另一个部位。 转座以很低的频率发生，而且转座子的插入是随机的.;转座发生的机制;90; 插入序列(insertion sequences, IS)组成：;插入序列发生转座的形式：;插入序列的复制性转座;29; 细菌的可流动性元件 A插入序列：转座酶编码基因两侧连接反向末端重复序列(箭头所示) B转座子Tn3：含有转座酶、β-内酰胺酶及阻遏蛋白编码基因 C转座子Tn10：含四环素抗性基因及两个相同的插入序列IS10L;31;32;33;;重组DNA技术是指在体外对DNA分子按照既定的目的和方案，对DNA进行剪切和重新连接，然后把它导入宿主细胞，从而能够扩增有关DNA片段，表达有关基因产物，进行DNA序列分析，基因治疗，以及研究基因的功能等。;36;限制性核酸内切酶(restriction endonuclease) ;38;第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写； 第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写； 第四个字母代表株，大写或小写； 用罗马数字表示发现的先后次序。;40;41;有些限制性内切酶虽然识别序列不完全相同，但切割DNA后，产生相同的粘性末端，称为同尾酶。这两个相同的粘性末端称为配伍末端(compatible end)。;来源不同的限制酶，但能识别和切割同一位点，这些酶称同裂酶或同功异源酶。;名