0501037DNS法测定糖化酶活力(精).docVIP

05-01-037DNS法测定糖化酶活力(精) 05-01-037DNS法测定糖化酶活力(精) PAGE / NUMPAGES 05-01-037DNS法测定糖化酶活力(精) 天津现代职业技术学院 3,5- 二硝基水杨酸 (DNS)法测定糖化酶活力 一、原理 糖化酶有催化淀粉水解的作用，能从淀粉分子非还原性尾端开始，分解 α -1,4- 葡萄糖苷键生成葡萄糖。在煮沸条件下，葡萄糖在碱性介质中被 3,5- 二硝 基水杨酸 (DNS)氧化成葡萄糖酸，而 3,5- 二硝基水杨酸被还原成红褐色的 3- 氨基 -5- 硝基水杨酸。 在必然范围内，还原糖的量与棕红色物质颜色的深浅成正比关系，利用分光光度计，在 540nm波长下测定光密度值，查对标准曲线并计算，即可求出淀粉经糖化酶水解后产生的葡萄糖总量。 由于多糖水解为单糖时， 每断裂 一个糖苷键需加入一分子水，所以在计算多糖含量时应乘以 0.9 。 反应过程以下： 二、仪器、试剂 1、仪器 具塞玻璃刻度比色管： 25mL×19； 烧杯： 100mL×4； 三角瓶： 100mL× 1； 容量瓶： 100mL× 3， 50mL× 3； 刻度吸管： 1mL× 4； 2mL×3；10mL×1； 开水浴； 冰浴； 扭力天平； UV—2802SH型紫外可见分光光度计尤尼柯（上海）仪器有限公司； 2、试剂 1 天津现代职业技术学院 1) 1mg/mL葡萄糖标准液 正确称取 80℃烘至恒重的解析纯葡萄糖 100mg，置于小烧杯中， 加少量蒸馏水溶解后，转移到 100mL容量瓶中，用蒸馏水定容至 100mL，混匀， 4℃冰箱中保存备用。 3,5- 二硝基水杨酸（ DNS）试剂 将 6.3g DNS和 262mL2M NaOH溶液，加到 500mL含有 185g 酒石酸钾钠的热水溶液中，再加 5g 结晶酚和 5g 亚硫酸钠，搅拌溶解，冷却后加蒸馏水定容至 1000mL，贮于棕色瓶中备用。 三、操作步骤 1、葡萄糖标准曲线的绘制 取 7 支 25mL具塞刻度比色管编号，按表 1 分别加入浓度为 1mg/mL的葡萄糖标准液、蒸馏水和 3,5- 二硝基水杨酸（ DNS）试剂，配成不同样葡萄糖含量的反应液。 管号 1mg/mL葡萄 蒸馏水 DNS 葡萄糖含量 光密度值 糖标准液（ mL） （ mL） （ mL） （mg） （ OD540nm） 0 0 2 1.5 0 1 0.2 1.8 1.5 0.2 2 0.4 1.6 1.5 0.4 3 0.6 1.4 1.5 0.6 4 0.8 1.2 1.5 0.8 5 1.0 1.0 1.5 1.0 6 1.2 0.8 1.5 1.2 表 1 葡萄糖标准曲线制作 将各管摇匀，在开水浴中正确加热 5min，取出，冰浴冷却至室温，用蒸馏 水定容至 25mL，加塞后颠倒混匀，在分光光度计进步行比色。调波长 540nm，用 0 号管调零点，测出 1~6 号管的吸光度。以吸光度为纵坐标，葡萄糖含量（ mg）为横坐标，做出标准曲线。 2、糖化酶活性测定 1) 将糖化酶粉剂或浓缩液稀释至 20~40 单位 / 毫升，制成酶制备液； 2 天津现代职业技术学院 取甲、乙两比色管（50 毫升），分别加入 2%可溶性淀粉溶液 25ml 和 0.1M 醋酸 - 醋酸钠缓冲溶液 5ml，摇匀，放入 40℃士 0.2 ℃的恒温水浴锅中水浴 5-10 分钟； 在甲管中加酶制备液 2ml, 摇匀，并记录时间，反应 10 分钟后 , 马上加入 20% NaOH溶液 0.2 毫升 , 摇匀； 将两管取出冷却 , 并于乙管中补加入酶制备液 2 毫升 ( 作为空白比较 ) ； 取上述反应液 2 毫升放于盛有 2 毫升 3,5 一二硝基水杨酸的 25 毫升比色管 中 , 按工作曲线的步骤以乙管为空白测其吸光度。 由吸光度值从工作曲线上查得葡萄糖的毫克数 , 再按下面的公式计算酶活力单位。 四、计算 以 1 克酶粉剂或 1 升发酵酶液在 40℃时 pH为 4.6 条件下 ,1 小时分解可溶性淀粉产生 1 毫克葡萄的酶量定义为一个酶活性单位。 酶活力单位 相当于测得吸光度的葡 萄糖毫克数 1 32.2 60 n k 2 (2) 10 式中： 1/2 一折算成 1 毫升酶液的量； 3 2.2 一反应液整体积的毫升数， 一吸取反应液毫升数 ; 60/10一转变为 1 小时的活性 一稀释倍数 ; 一常数 ( 包括时间 , 双糖影响等 ) 3