基因表达和基因重组.pptx

基因重组和基因工程 Genetic Recombination and Genetic Engineering;概论;基因重组：不同的DNA分子间发生共价连接形成重组DNA 分子。;;;;;人体生长激素释放激素(SS); ;第 一 节DNA的重组 DNA Recombination;DNA重组;发生在同源序列间的重组称为同源重组(homologous recombination)，又称基本重组。是最基本的DNA重组方式，通过链的断裂和再连接，在两个DNA分子同源序列间进行单链或双链片段的交换。 ;二、细菌的基因转移与重组;可接合质粒如 F 因子(F factor) ;（二）转化作用;例：溶菌时，裂解的DNA片段被另一细菌摄取。;;（三）转导作用;λ噬菌体的生活史;;第 二 节 重组DNA技术;;一、重组DNA技术相关概念 ;技术水平：分子克隆(molecular clone) 即DNA 克隆 细胞克隆 个体克隆（动物或植物）　;DNA克隆 应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传物质（同源的或异源的、原核的或真核的、天然的或人工的DNA）与载体DNA接合成一具有自我复制能力的DNA分子——复制子(replicon)，继而通过转化或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增提取获得大量同一DNA分子，也称基因克隆或重组DNA (recombinant DNA) 。 ;生物技术工程: 基因工程、蛋白质工程、酶工程、细胞工程等;（二）工具酶;重组DNA技术中常用的工具酶;限制性核酸内切酶;作用 与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰系统，限制外源DNA， 保护自身DNA。;第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写； 第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写； 第四个字母代表株； 用罗马数字表示发现的先后次序。;Ⅱ类酶识别序列特点—— 回文结构(palindrome) ;Bam HⅠ;同功异源酶 来源不同的限制酶，但能识别和切割同一位点，这些酶称同功异源酶。;有些限制性内切酶虽然识别序列不完全相同，但切割DNA后，产生相同的粘性末端，称为同尾酶。这两个相同的粘性末端称为配伍未端(compatible end)。;（三）目的基因; 按照人的愿望设计和建造非天然的基因表达体系。; cDNA： 经反转录合成的、与mRNA互补的DNA链。 基因组DNA： 代表一个细胞或生物体整套遗传信息的所有DNA序列。;（四） 基???载体;;载体的选择标准; 存在于细菌染色体外的小型环状DNA分子。 具有自我复制功能。 带有抗性基因及表型识别等遗传性标记物。 经改造后具有多克隆位点。 举例：pBR322质粒;;;;;;;;;λ噬菌体DNA改造系统 λgt系列（插入型，适用cDNA克隆） EMBL系列（置换型，适用基因组克隆）; 粘性质粒(cosmid);酵母人工染色体 (yeast artificial chromosome, YAC) 细菌人工染色体 (bacterial artificial chromosome, BAC) 动物病毒DNA改造的载体 （如腺病毒，腺病毒相关病毒，逆转录病毒）;二、重组DNA技术基本原理; 以 质 粒 为 载 体 的 DNA 克 隆 过 程;（一）目的基因的获取;* 化学合成法获取目的基因;组织或细胞染色体DNA;; cDNA文库 以 mRNA 为模板，利用反转录酶合成与mRNA互补的DNA，再复制成双链 cDNA，与适当载体连接后转入受体菌，即获得cDNA文库。;mRNA的提取与纯化;cDNA;; 聚合酶链式反应（PCR）;;（三）外源基因与载体的连接;Bam HⅠ切割反应;不同限制酶切位点（非配伍末端）的连接;2. 平端连接 适用于：限制性内切酶切割产生的平端 粘端补齐或切平形成的平端;目的基因;3. 同聚物加尾连接 在末端转移酶(terminal transferase)的作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再进行粘端连接。;5′ 3′;4. 人工接头(linker)连接 由平端加上新的酶切位点，再用限制酶切除产生粘性末端，而进行粘端连接。 ;人工接头及其应用;受体菌条件 安全宿主菌 限制酶和重组酶缺陷 处于感受态(competent) ;（五）重组体的筛选 1. 直接选择法 (1) 抗药性标记选择 (2) 标志补救(marker rescue)