过氧化物酶专题知识讲座.ppt

过氧化物酶专题知识讲座;一、试验目;二、试验原理;2．酶活力测定 (1) 酶活力 表示酶量多少不能像通常物质那样, 用重量(g)或体积(ml)。因为酶是一个生物催化剂。酶存在和含量多少应表现在催化能力大小, 即用酶活力(活性)表示。 酶活力（酶活性）指酶催化某一特定化学反应能力。催化能力强(大), 酶活力就高(大), 也表示酶量多。酶本身重量不能说明酶实际含量多少。一样重量酶, 酶活力能够不一样, 活力高, 价值就大。;(2) 酶促反应速度 酶活力具体用它所催化某一化学反应反应速度来表示, 即在最适条件下(最适pH、最适T) 酶催化反应速度愈快, 酶活力就愈高。速度愈墁, 酶活力就愈低。所以测定酶活力(实质上就是酶定量)测定就是测定酶促反应速度(用v表示) 。 酶促反应速度可用单位时间内、单位体积中底物降低许或产物增加量来表示。单位: 浓度/单位时间 常见产物增加量表示, 因为它从无到有, 改变显著。酶促反应随时间增加, 产物增加。 ;若将产物浓度对反应时间作图得到酶促反应速度曲线。 ;从图可知, 反应速度只在最初一段时间内保持恒定, 伴随反应时间延长, 酶反应速度逐步下降。引发下降原因很多, 如底物浓度降低, 产物浓度增加而加速了逆反应进行, 产物对酶有抑制作用等。所以研究酶反应速度以酶促反应初速度为准, 即酶促反应最初一段时间, 产物呈线性增加时反应速度。具体指酶促反应速度曲线斜率。即从原点对曲线作切线, 求切线斜率( v ) = 浓度 / 时间;因为产物从无到有, 只要方法灵敏, 可正确测定。测定产物增加量方法很多: 化学方法: 滴定、比色、气体测压、电化学等。 物理方法: UV吸收、荧光等。 同位素方法等。;(3) 酶活力单位 表示酶活力大小, 也就是酶量大小单位称酶活力单位(U)。 国际单位(IU)定义: 1个酶活力单位, 是指在特定条件下, 在1分钟内能转化1微摩尔( μmol)底物酶量, 或是转化1微摩尔底物中相关基团酶量。;3、测定原理 过氧化物酶催化过氧化氢氧化酚类反应, 产物为醌类化合物, 此化合物深入缩合或与其她分子缩合, 产生颜色较深化合物。本试验以邻甲氧基苯酚（即愈创木酚）为过氧化物酶底物, 在此酶存在下, H2O2可将邻甲氧基苯酚氧化成红棕色4-邻甲氧基苯酚, 其反应为: ;本试验用紫外吸收法测定产物4－邻甲氧基苯酚在470nm光吸收增加值表示产物增加量, 划出光吸收 - 时间速度曲线, 求出曲线斜率, 即酶促反应初速度, 再换算为酶活力。;;2. pH对酶促反应速度影响;(2) pH对酶促反应速度影响 大多数酶活力受其环境pH影响。这是因为pH影响底物分子和酶分子中部分基团解离, 这些基团离子化状态关系到底物与酶结合、酶专一性和酶活性中心构象。通常多种酶只有在一定pH范围内才含有活性, 并在一定pH下, 酶促反应含有最大反应速度, 此pH称最适pH, 高于或低于此值反应速度都下降。 ;如将反应速度对pH作曲线, 经典呈钟罩形, 但不一样酶受pH影响是不一样, 所以会有不一样形状, 有只有钟罩形二分之一, 有则是一直线, 即受pH影响不大。;木瓜蛋白酶;不一样酶最适pH也不一样, 如胃蛋白酶为pH 1.5 - 2.5、胰蛋白酶为pH 8。但应注意最适pH不是特征常数, 对于同一个酶, 其最适pH因底物种类、浓度及缓冲液成份不一样而有差异, 所以酶最适pH并不是一个常数, 只是在一定条件下才有意义。通常最适pH在6 - 8之间。 因为酶活力受pH影响很大, 所以在测定酶活力时, pH必需恒定, 所以测活反应最好在缓冲液体系中进行。;本试验测定三亇不一样pH下过氧化物酶时间－光吸收关系曲线, 比较三亇不一样pH ( 6.0,7.0,8.0)条件对过氧化物酶活力影响。;三、试验操作;2、 酶活力测定 (1)取1只比色杯洗净控干, 按以下步骤操作: 用移液管吸收0.1 mol/L反应液(pH 6.0) 2.9mL 加入比色杯中。 放入紫外分光光度计比色杯架内, 按auto zero, 出现插入空白, 按ok, 仪器自动调零。调零完成后按start, 出现插入样品。 (2)取出比色杯, 1人加酶液(μL), 先加20 μL , 另1人同时按ok开始计时, 加酶后盖上硫酸纸, 按紧混匀, 30秒内放入比色杯架内, 仪器每30秒自动统计光吸收值A470nm。 (3)按数据处理中数据打印, 显示8个数据, 统计数据。;(4)操作关键点: * 关键是酶稀释倍数和酶量多少要适宜, 使ΔA470nm在0.2~0.4/min, 即第1个30秒A470nm在0.1- 0.2。过低过高都应增加或降低酶量重新做。 * 加酶后应快速摇匀, 立刻计算时间,