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生物制药专题知识讲座;第二章 基因工程制药;第一节 概述 ;利用基因工程技术生产药品 优点 ;伴随20世纪70年代DNA重组技术 建立, 基因工程制药开始得到快速 发展。 1977年, 重组生长激素抑制因子克隆成功后, 美国成立了第一家基因工程企业。 1982年, 美国Eli Lilly制药企业首先将重组胰岛素投放市场, 标志着世界第一个基因工程药品 诞生。 现在, 全球上市 基因工程药品有140多个, 有1700多个处于临床研究阶段, 2600多个在试验室研究阶段。其中促红细胞生成素、人重组胰岛素、人重组干扰素、乙肝疫苗、葡萄脑苷脂酶、组织纤溶酶原激活剂、生长激素、白介素-2、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子等年销售额都在5000万美元以上, 仅促红细胞生成素1个药销售额就达百亿美元。 ;中国从80年代早期开始基因工程药品 开发研究 1989年, 第一个基因工程药品干扰素同意上市; 1992年, 第一个基??工程乙肝疫苗投入市场。 现在, 中国已经有20多个基因工程药品上市, 销售额排名世界前10位 基因工程药品中国能生产8种, 另有150多个处于临床研究阶段。 与优异国家相比, 中国在基因工程制药上还有相当大 差距。伴随中国科学技术水平 不停提升, 再加上国家 重视和大力支持, 中国 基因工程制药产业将得到快速发展。;基因工程药品生产 过程 ;第二节 基因工程制药基础知识 ;一、基因工程菌 构建与筛选;（一）载体 ;1．质粒载体;质粒 3种构型;质粒 生物特征;用于克隆 质粒载体要含有 三个要素 ;用于表示 质粒载体要含有 要素;表示载体可分为原核表示载体和真核表示载体两类;2．λ噬菌体载体;18;（二）目 基因 常见制备方法 ;20;1. 化学合成法 ; 人工化学合成基因 限制 ;2. PCR法 ;24;3. 基因文库法 ;4. cDNA文库法 ; 逆转录法制备cDNA ;(1) mRNA 提取与纯化 ;(2) cDNA第一链 合成 ;(3) cDNA第二链 合成 ;31;（三）载体DNA与目 基因 连接 ;1．黏性末端DNA片段与载体DNA 连接 ;2．平头末端DNA片段与载体DNA 连接 ;1) 加同聚尾连接: 用3′ 末端脱氧核苷酸转移酶催化, 使载体与cDNA 3′ 末端带上互补 同型多聚体序列。 如载体加上poly C(或A) 尾巴则cDNA加上poly G(或T) 尾巴, 这???种黏性末端只能使载体与cDNA连接而不能自我环化, 借助同型多聚体 退火作用形成重组分子, 最终用T4 DNA连接酶封口。;36;2）人工接头连接: 用T4 DNA连接酶在平末端接上人工接头能够使DNA发生连接。 所谓人工接头是指由人工合成 、连接在目 基因两端 含有部分限制酶切点 寡核苷酸片段。 cDNA连上人工接头后, 用该种限制酶酶切就可得到黏性末端, 从而能够与载体连接; cDNA中可能也带有一样 限制酶切点, 为了保护cDNA不受限制酶破坏, 确保其完整, 能够在加接头前先用甲基化酶修饰这些限制酶切点;38;3．影响目 基因与载体之间连接效率 关键原因;（四）重组DNA导入宿主细胞 ;1．重组DNA导入大肠杆菌;42;2．重组DNA导入酵母;3．重组DNA导入链霉菌;4．重组DNA导入哺乳动物细胞;（五）重组子 筛选与判定 ;（2）互补筛选法: 重组子转化宿主细胞, 载体 表示产物与宿主细胞中营养缺点型突变发生互补作用, 从而实现重组子 筛选。最常见 为蓝白筛选。 ;48;49;（3）营养缺点性筛选法: 载体携带部分营养成份（如某种氨基酸） 编码基因, 而宿主细胞因该基因突变而不能合成该生长所必需 营养物质。所以只有含转化子 菌落才能够在缺乏该营养物质 培养板上生长从而实现筛选。 （4）噬菌斑筛选法: 经噬菌体载体包装 外源重组DNA转染宿主细胞, 转化子在固体培养板上出现清楚 噬菌斑, 不含外源DNA 空载体因长度过小不能装配成噬菌体颗粒不能感染宿主细胞形成噬菌斑, 从而实现筛选 目 。;51;2．核酸分子杂交法 （1）菌落原位杂交: 菌落原位杂交又称探针原位杂交法, 制备与目 基因某一区域同源 探针序列, 依据核酸杂交原理, 探针序列特异性地杂交目 基因, 并经过放射性同位素或荧光基团进行定位检测。;（2）DNA印迹分析: 1975年E.M. Southern发明Southern印迹法（South