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PAGE PAGE 1 MTS比色法、XTT比色法、CCK MTS[3-（4，5-dimethylthiazol-2-yl）-5（3-carboxymethoxyphenyl）-2-（4-sulfopheny）-2H-tet-razolium, inner salt]是一种四唑类化合物，它与MTT的应用原理相同，即被活细胞线粒体中的多种脱氢酶还原成有色的水溶性产物，其色彩深浅与细胞活性呈高度相关。MTS比MTT更为便利，精简了试验过程。 【材料】1. MTS 用pH 6.0的PBS配成300mmol/L;2．吩嗪二甲醋硫酸盐（PMS) 用PBS配制成220mmol/L,4℃避光可保存20天；3. MTS/PMSMTS与PMS按1：1混合（临用时混合）；4. K562细胞（靶细胞），淋巴细胞（效应细胞）。【办法】1．在96孔细胞培养板中（用前紫外线照耀4小时），试验孔加效、靶细胞各100ul，效：靶=10～20：1；靶细胞对比孔只加靶细胞、培养液100ul。每个标本3个复孔，37℃ 5% C02孵箱中作用4小时。2．每孔加MTS溶液20ul，继续孵育2小时。【结果】挑选490nm波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光汲取值，记录结果。XTT比色法（NK细胞毒实验）【原理】XTT是与MTT类似的四唑氮衍生物，可被活细胞线粒体脱氢酶还原成水溶性的棕色产物，当XTT与电子耦合剂共同用法时，产物的生成量与细胞的增殖程度呈正相关。用XTT代替MTT可省去溶解还原产物结晶的步骤。【材料】1. XTT用60℃预热培养液配制成6.6mmol/L，过滤除菌，现配现用。2．吩嗪二甲酯硫酸盐(PMS)用PBS配制成220mmo1/L,4℃避光可保存20天。3. XTT/PMS:XTT，与PMS按1：1混合（临用时混合）。4. K562细胞（靶细胞）,NK细胞（效应细胞）。【办法】1．在96孔细胞培养板中（用前紫外线照耀4小时），试验孔加效、靶细胞各100ul，效：靶=10：1;靶细胞对比孔只加靶细胞、培养液100ul。每个标本3个复孔，37℃ 5% C02孵箱中作用4小时。2．于终止培养前2小时，每孔加入XTT/PMS 20ul，混匀后再培养2小时。【结果】在酶标仪上450nm处测定光吸光度，参考波长为655 nm。计算Sl：Si=实验孔OD均值／对比孔OD均值。【注重事项】1. XTT试剂应现用现配。2．细胞洗涤要充分，操作要无菌、轻柔，保持细胞活性。CCK-8法（CTL细胞毒试验）【原理】所谓CCK-8 (cell counting Kit-8 )法的细胞活性检测试剂中含有WST-8，其化学名为：2-(2-甲氧基-4-硝基苯基）-3-(4-硝基苯基）-5-(2,4-二磺酸苯）-2H-四唑单钠盐，它在电子载体1-甲氧基-5甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯(1-Methoxy PMS )的作用下被细胞线粒体中的还原为具有高度水溶性的黄色甲臜产物（Formazan)。生成的甲臜物的数量与活细胞的数量成正比。用酶联免疫检测仪在450nm波特长测定其光汲取值，可间接反映活细胞数量。WST-8比MTT,XTT,MTS越发稳定，检测线性范围更宽，敏捷度更高，但价格较贵。【材料】1．培养液中靶细胞通常选用传代的肿瘤细胞，配制成（1～3)x106/ml细胞悬液；2．效应细胞CTL可用受检患者外周血液中分别所得的单个核细胞，洗涤后调节细胞数；3.CCK-8；4.RPMI 1640。【办法】1．常规办法分别淋巴细胞，在96孔细胞培养板中根据淋巴细胞与肿瘤细胞200:1的效靶比例使两种细胞接触。假如肿瘤细胞为贴壁细胞，则将肿瘤细胞用培养液配成1x103/ml的细胞悬液，每孔加入细胞悬液100ul（即100个肿瘤细胞，静置5～10分钟，待细胞初步贴壁后，再放入5% CO2的细胞培养箱中培养24小时。如每孔中含肿瘤细胞为200个，则应加入淋巴细胞4x104个淋巴细胞，即每孔加入4x105/ml淋巴细胞悬液100 ul。2．用含20％的RPMI 1640培养液将每孔液体体积补至200ul，将每孔细胞培养板放入5% CO2的37℃细胞培养箱内培养24～48小时。3．每孔加入20ul CCK-8溶液。用加了相应量细胞培养液和CCK-8溶液但没有加入细胞的孔作为空白对比。在细胞培养箱内继续孵育1小时。【结果】用酶标仪在450nm测定吸光度值。【注重事项】1．假如细胞培养时光较长，一定要注重蒸发的问题。一方面，因为96孔板周围一圈最简单蒸发，可以实行弃用周围一圈的方法，改加PBS，水或培养液；另一方面，可以把96孔板置于逼近培养箱内水源的地方，以缓解蒸发。2．本办法的检测依靠于脱氢酶催化的反应，假