杭州甲型副伤寒分离菌株脉冲场凝胶电泳分型.docVIP

杭州甲型副伤寒分离菌株脉冲场凝胶电泳分型 目录 TOC \o 1-9 \h \z \u 目录 1 正文 1 文1：杭州甲型副伤寒分离菌株脉冲场凝胶电泳分型 1 1 对象与方法 2 12 方法 2 2 结果 3 3 讨论 4 文2：杭州甲型副伤寒分离菌株脉冲场凝胶电泳分型 5 1 对象与方法 5 12 方法 5 2 结果 7 3 讨论 8 参考文摘引言： 8 原创性声明（模板） 10 文章致谢（模板） 10 正文 杭州甲型副伤寒分离菌株脉冲场凝胶电泳分型 文1：杭州甲型副伤寒分离菌株脉冲场凝胶电泳分型 脉冲场凝胶电泳(pulse field gel electrophoresis, PFGE)分型为一种重复性好、分辨率高的细菌分子分型方法，被广泛应用于细菌感染的分子流行病学研究。近年来，杭州地区发生多起甲型副伤寒暴发疫情，部分地区反复多次发生，已成为严重的公共卫生问题。本文应用PFGE分型技术分析了2002～2005年杭州地区5起暴发疫情和10起散发病例的分子流行病学特征，并进行抗生素敏感性观察。现将结果报告如下。 1 对象与方法 11 菌株来源与鉴定 收集2002～2005年杭州市L县和X区甲型副伤寒患者血培养及粪便中分离的甲型副伤寒沙门菌171株，其中分离自L县3起暴发疫情103株，散发病例3株；分离自X区2起暴发疫情58株，散发病例7株。菌株均由杭州市疾病预防控制中心微生物检验科依据GB 16001-1995进行鉴定。鉴定试剂：肠杆菌科鉴定试条ATB ID32E(法国生物梅里埃公司)；沙门菌诊断血清（成都生物制品所、兰州生物制品所），均在有效期内使用。 12 方法 121 仪器与试剂 (1)主要仪器：CHEF DRII 脉冲场电泳仪、BioRad凝胶图像分析系统、BioRad紫外分析仪(美国BioRad公司)。(2)主要试剂：蛋白酶K（上海Sangon公司）；XbaI(日本TaKaRa公司)；Seakem Gold琼脂糖(美国Cambrex公司)、05×TBE(自行配制)；Marker沙门菌braenderup血清型H9812株（ 中国 疾病预防控制中心惠赠） 122 药物敏感性试验 选择14种抗生素，采用WHO推荐的改良Kirby-Bauer纸片法进行药物敏感试验。14种抗生素药敏纸片、Mueller-Hinton琼脂(杭州微生物试剂厂)，均在有效期内使用。结果判定参照卫生部制定的《纸片法抗菌药物敏感试验标准》（WS/T 125-1999）。质控菌株为大肠埃希菌ATCC25922、铜绿假单胞菌ATCC27853、金黄色葡萄球菌ATCC25923，均为本实验室保存。 123 PFGE分型 从每起暴发疫情分离菌株中各选择1株以及散发病例分离株作为代表菌株，计15株；操作方法按照美国疾病预防控制中心PFGE标准方法〔1〕并略加改进：Luria-Bertani（LB）平板划菌37℃过夜,无纤维棉签沾取细菌到25ml细菌悬浮液A600比浊，吸光度12～14之间。于400μl菌液加入20μl蛋白酶K(20mg/ml)，再与等体积的预熔1%Seakem Gold琼脂糖:1%十二烷基磺酸钠(SDS)溶液混匀后，制备琼脂块。用50μg/ml蛋白酶K液消化2h。分别用15ml双蒸水和TE洗2和4次，消化和洗涤均在54℃摇床170min中进行。然后切胶至15ml PE管中，于37℃水浴中以25U XbaI酶切2h。将胶条包埋于1%Seakem Gold琼脂糖〔05×Tris-硼酸(TBE)缓冲液〕。CHEFOⅡ电泳仪电泳19h,脉冲电泳起始转换时间为22s、最后转换时间为638s、电压为6V/cm、角度120°，电泳液为05×TBE缓冲液，电流控制在140mA左右，电泳缓冲液温度保持在14℃。溴化乙锭染色，凝胶图像分析系统保存结果。分型判别标准：按 文献 判别标准〔2〕, 酶切后图谱完全一致,判定为同一型；酶切后图谱有1～3条条带不同者，判定为菌株间关系较密切；酶切后图谱如有3条以上条带不同者，则判定为菌株间关系不密切。同时采用Dice相似性系数评估PFGE图谱间的相似性〔3〕，应用Quantity one软件 计算 电泳条带分子量。 2 结果 21 PFGE分型 分型结果可见，15株甲型副伤寒沙门菌分别产生19～20条条带，可分为A、B、C、D等4种型别,带型变化分别发生在6511，4016，3275，746，411Kb处，4型之间分别有1～4 条电泳条带的差异（图1） M：Marker(XbaI 酶切H9812株)；1：A型；3～7：B型；2,8,9,11～15：C型；10：D型 图1