人甲胎蛋白异质体3afpl3酶联免疫分析试剂盒使用方法.docxVIP

人甲胎蛋白异质体3(AFP丄3)酶联免疫分析试剂盒使用方法 本试剂盒仅供研究使用。 检测范围： 96T 50ng/L -1600ng/L / \ 使用目的： 本试剂盒用于测定人甲胎蛋白异质体 3(AFP-L3)含量。 实验原理 本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中人甲胎蛋白异质体 3(AFP-L3)水平。用纯化的人 甲胎蛋白异质体 3(AFP-L3)抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入 甲胎蛋白异质体 3(AFP-L3),再与HRP标记的甲胎蛋白异质体 3(AFP-L3)抗体结合，形成抗 体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物 TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转 化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的甲胎蛋白异质体 3(AFP-L3)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度 (0D值)，通过标准曲线计算样 品中人甲胎蛋白异质体 3(AFP-L3)浓度。 试剂盒组成 1 30倍浓缩洗涤液 20ml X 1 瓶 7 终止液 6ml X 1 瓶 2 酶标试剂 6ml X 1 瓶 8 标准品(3200 ng/L ) X 1瓶 3 酶标包被板 12孔X 8条 9 标准品稀释液 X 1瓶 4 样品稀释液 6ml X 1 瓶 10 说明书 1份 5 显色剂A液 6ml X 1 瓶 11 圭寸板膜 2张 6 显色剂B液 6ml X 1/瓶 12 密封袋 1个 标本要求 1 ?标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能 马上进行试验，可将标本放于 -20 C保存，但应避免反复冻融 不能检测含 NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的(HRP)活性。 组织处理：切割标本后，称取重量。加入一定量的PBS,。用液氮迅速冷冻保存备用。 标本融化后仍然保持 2-8C的温度。加入一定量的 PBS (),用手工或匀浆器将标本 匀浆充分。离心 20分钟左右(2000-3000转/分)。仔细收集上清。分装后一份待检 测，其余冷冻备用。 操作步骤 标准品的稀释：本试剂盒提供原倍标准品一支， 用户可按照下列图表在小试管中进行稀 释。 1600ng/L 5号标准品 150 d 的原倍标准品加入150 d标准品稀释液 800ng/L 4号标准品江 150 d 的5号标准品加入150 d标准品稀释液 400ng/L 3号标准品 150 d 的4号标准品加入150 d标准品稀释液 200ng/L 2号标准品 150 d 的3号标准品加入150 d标准品稀释液 100 ng/L 1号标准品 150 d 的2号标准品加入150 d标准品稀释液 加样：分别设空白孔(空白对照孔不加样品及酶标试剂， 其余各步操作相同)、标准孔、 待测样品孔。在酶标包被板上标准品准确加样 50山,待测样品孔中先加样品稀释液 40山, 然后再加待测样品10 d （样品最终稀释度为 5倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽 量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。 3. 温育：用封板膜封板后置 37 C温育30分钟。 4. 配液：将20倍浓缩洗涤液用蒸馏水/ 20倍稀释后备用 5. 洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置 30秒后弃去，如此 重复5次，拍干。 6. 加酶：每孔加入酶标试剂 50 d，空白孔除外。 \ 7. 温育：操作同3。/ 8. 洗涤：操作同5。 9. 显色：每孔先加入显色剂 A50 d，再加入显色剂 B50 d，轻轻震荡混匀，37 C避光显色 15分钟. 10. 终止：每孔加终止液 50 d，终止反应（此时蓝色立转黄色） 。 \ 11. 测定：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（ OD值）。测定应在加终止 液后15分钟以内进行。 操作程序总结: 计算 以标准物的浓度为横坐标， 0D值为纵坐标，在坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的 OD值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与 0D值计算出标 准曲线的直线回归方程式， 将样品的0D值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数， 即为样品的实际浓度。 注意事项 1试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡 15-30分钟后方可使用，酶标包被板开封后如未 用完，板条应装入密封袋中保存。 2?浓洗涤液可能会有结晶析出，稀释时可在水浴中加温助溶，洗涤时不影响结果。 3?各步加样均应使用加样器，并经常校对其准确性，以避免试验误差。一次加样时间最好 控制在5分钟内，如标本数量多，推荐使用排枪加样。 请每次测定的同时做标准曲线，最好做复孔。如标本中待测物质含量过高（样本 0D值 大于标准品孔第一孔的 0D值），请先用样品稀释液稀释一定倍数（ n倍）后再测定，计 算时请最后乘以总稀释倍数（X n X 5）。 \ 封板膜只限一