硫化氢在脂多糖所致老年大鼠急性肺损伤中的作用.docVIP

硫化氢在脂多糖所致老年大鼠急性肺损伤中的作用 目录 TOC \o 1-9 \h \z \u 目录 1 正文 1 文1：硫化氢在脂多糖所致老年大鼠急性肺损伤中的作用 1 1 材料与方法 2 2 结 果 4 3 讨 论 6 文2：PPARα在老年大鼠酒精性肝损伤脂质过氧化中的作用 7 1 材料与方法 7 2 结 果 9 3 讨 论 10 参考文摘引言： 11 原创性声明（模板） 13 文章致谢（模板） 13 正文 硫化氢在脂多糖所致老年大鼠急性肺损伤中的作用 文1：硫化氢在脂多糖所致老年大鼠急性肺损伤中的作用 急性肺损伤（acute lung injury，ALI）主要病变特点是急性弥漫性肺泡和肺血管损伤，最终可 发展 至急性呼吸窘迫综合征，其发病机制尚未完全阐明。内源性气体信号分子NO和CO在ALI中的作用已得到证实〔1～3〕，研究表明H2S可能是继NO和CO之后的第3种气体信号分子〔4〕，参与神经和血管功能调节等多种生理和病理过程〔5～7〕。但H2S是否参与ALI的发病尚不清楚。研究发现，H2S和NO共同参与了LPS所致的肺动脉反应性异常〔8〕，推测H2S和NO、CO之间可能也存在某种联系。本研究着重观察ALI时H2S及其生成关键酶胱硫醚γ裂解酶（cystathionineγlyase，CSE）的变化；并应用H2S供体NaHS和CSE抑制剂炔丙基甘氨酸（propargylglycine，PPG）观察H2S对ALI时肺组织损伤指标和NO/诱导型NO合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）、CO/血红素加氧酶1（hemeoxygenase1，HO1）体系变化的影响，探讨H2S在LPS所致ALI中的作用及可能的机制。 1 材料与方法 动物 清洁级健康雄性SD大鼠64只，20月龄，体重350～400 g（购于河北医科大学实验动物中心），自由摄食、饮水，室温18℃～24℃，相对湿度40%～70%，每日12 h光照维持，昼夜循环。 方法 试剂 大肠杆菌脂多糖（LPS O111:B4）、NaHS、炔丙基甘氨酸(PPG)、L半胱氨酸、5′磷酸吡哆醛、N，N二甲基对苯二胺硫酸盐、血红蛋白、血红素、NADP、6磷酸葡萄糖和6磷酸葡萄糖脱氢酶均购自Sigma 公司，抗iNOS多克隆抗体、抗HO1多克隆抗体购自博士德公司，SP免疫组化检测试剂盒购自北京中杉生物技术公司，NO与CO、iNOS与HO、丙二醛（MDA）、考马斯亮蓝检测试剂盒购自南京建成生物公司。 模型制备 SD大鼠适应性喂养1 w后，按窝别随机分为对照组、LPS组、NaHS+LPS组、PPG+LPS组，每组16只。对照组气管内滴注等量生理盐水200 μl/只；LPS组气管内滴注LPS（200 μg/只，溶于200 μl生理盐水中）；NaHS+LPS组LPS滴注前10 min腹腔注射NaHS（28 μmol/kg，溶于 ml生理盐水）；PPG+LPS组滴注LPS前10 min腹腔注射PPG（45 mg/kg，溶于 ml生理盐水） 检测指标 滴注药物后4 h或8 h颈总动脉放血处死动物。取血浆采用去蛋白的分光光度法〔5〕根据H2S标准曲线 计算 上清液中H2S的含量；采用硝酸还原酶法间接测定血浆NO含量；参照Chalmber等〔9〕的双波长分光光度法，以血浆中HbCO的百分比含量(%)代表CO含量；取全肺自气管分叉以上5、6软骨环间剪断气管，用滤纸吸干肺表面血污后称质量测定肺系数［肺系数=全肺湿质量(g)/体质量(kg)］。留取左侧肺叶下部以10%中性甲醛溶液固定，常规石蜡包埋、切片，经HE染色采用分光光度法测定iNOS及HO1活性（HO活性检测采用HO降解血红素生成胆绿素和CO的原理，以1 mg HO蛋白1 h催化血红素降解生成胆红素的pmol数，以此表示HO活性）。取左侧肺叶中上部制备肺组织匀浆，采用硫代巴比妥酸法测定肺组织中MDA含量；参照 文献 〔6〕方法测定肺组织CSE活性（组织中CSE活性以每毫克组织在每分钟生成H2S的nmol表示） 肺组织形态学观察 光镜下观察肺组织形态结构变化。每组选取6张玻片，每张玻片连续观察10个视野（100倍），计算损伤肺泡（肺泡内含有红细胞或/和中性粒细胞2个以上）数占计数肺泡总数百分比，即肺泡损伤数比值作为肺损伤的组织学定量评价指标（IQA） 肺组织中iNOS蛋白、HO1蛋白的免疫组织化学检测及计算机图像分析 采用SABC法检测大鼠肺组织iNOS蛋白、HO1蛋白表达。切片常规脱蜡、脱水，一抗滴度为1∶100，DAB显色，苏木素复染，脱水、透明、封片。以PBS代替一抗作为阴性对照，细胞浆染成