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牙龈卟啉单胞菌诱导人白细胞脱颗粒的体外观察 目录 TOC \o 1-9 \h \z \u 目录 1 正文 1 文1：牙龈卟啉单胞菌诱导人白细胞脱颗粒的体外观察 1 1 材料与方法 2 2 结 果 3 3 讨 论 4 文2：人白介素24基因诱导人宫颈癌CaSki细胞凋亡的实验研究 5 1材料和方法 6 参考文摘引言： 10 原创性声明（模板） 11 文章致谢（模板） 12 正文 牙龈卟啉单胞菌诱导人白细胞脱颗粒的体外观察 文1：牙龈卟啉单胞菌诱导人白细胞脱颗粒的体外观察 慢性牙周炎在中老年人中的患病率极高，是导致中老年人群牙齿缺失的主要原因。牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis，）是慢性牙周炎重要的可疑致病菌之一〔1〕，可通过其可溶性产物对牙周组织造成损伤，而多形核白细胞（polymorphonuclear leukocytes，PMNLs）是机体抵抗病菌入侵的第一道防线〔2〕。在牙周炎发病过程中，宿主自身抵抗力的差异性是一个重要的因素，PMNLs的功能正常与否，直接关系着机体免疫力的高低。研究发现：牙周致病菌与PMNLs的相互作用在牙周病的致病机制中起重要作用〔3，4〕。目前针对可溶性毒力因子对PMNLs影响的系统研究较少，本研究旨在通过观察超声滤液诱发PMNLs脱颗粒的形态变化，探讨可溶性毒力因子对PMNLs的影响。 1 材料与方法 细菌菌种与研究对象 标准菌株ATCC33277（购自上海市口腔医学研究所）。选择10例健康老年人为试验对象，男女各5例，平均年龄（60±5）岁，所有受试者均知情同意。受试者的选择标准包括：无全身性疾病；近3个月无服用抗生素类药物；无活动性龋，牙周健康。 方法 细菌的培养及超声滤液的制备 将接种在血液琼脂培养基中（营养琼脂加10%新鲜兔血），10% CO2的厌氧环境，37℃培养24 h。将生长良好的细菌用生理盐水洗下，配置成2单位麦氏比浊管的浓度（6×108CFU/ml），将该浓度的细菌置超声仪中超声粉碎（PG115型超声破碎仪，德国MSE公司），取上清进行过滤，滤过液置4℃保存备用。 外周血PMNLs的分离培养 取10例健康老年人静脉血20 ml，肝素抗凝后，用不连续密度梯度Percoll分离PMNLs。先将70%浓度Percoll溶液缓慢加入试管中，再加50%浓度的Percoll溶液，使之形成满意的界面。加抗凝血（约 ml）后离心25 min，收取多形核细胞层，将细胞用不含血清的培养液洗涤2次，用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液制成细胞悬液（5×106/ml），37℃，5% CO2孵箱中培养24 h。 细菌超声滤液作用于PMNLs 随机分为两组，实验组在PMNLs内加入超声粉碎滤液200 μl，对照组的PMNLs内加入RPMI 1640培养液。在0、10、30和60 min 4个时间段进行电镜观察。 透射电镜样品的制备 将细胞悬液离心15 min，沉积细胞经%戊二醛固定，1%锇酸固定后，乙醇系列脱水，Epon812环氧树脂包埋，超薄切片后用醋酸双氧及柠檬铅双重染色，透射电镜（JEM1200EX）观察、摄片。 统计学分析 用统计软件进行数据分析。采用成组设计两样本均数比较t检验。 2 结 果 超声滤液诱发PMNLs脱颗粒的形态变化 电镜观察显示：对照组中各时间点PMNLs形态完整，细胞浆内无明显颗粒，细胞膜边缘整齐，细胞核呈分叶状、饱满（图1A）。而实验组中PMNLs在超声滤液作用10 min时，细胞内有明显的颗粒聚集并向细胞周边移动的现象（图1B），在30和60 min时，PMNLs出现脱颗粒现象，同时伴有细胞不完整，细胞膜不光滑，细胞核皱缩的现象（细胞凋亡出现），甚至出现细胞裂解死亡（图1C、1D） 脱颗粒的PMNLs与正常PMNLs百分数的比较 的超声滤液加入PMNLs后在0、10、30、60 min 4个时间点利用电镜观察。结果显示：在10、30和60 min 3个时间点变现出差异，实验组在10 min时脱颗粒的PMNLs增多，在之后的时间里得到了持续，而对照组波动较实验组稳定。见表1。表1 两组脱颗粒的PMNLs数（略） 3 讨 论 老年人的牙周附着丧失重于年轻人，慢性牙周炎多见于中老年人。 牙龈卟啉单胞菌是目前公认的牙周致病菌之一，也是牙周微生物领域重点研究的厌氧菌之一，与慢性牙周炎、侵袭性牙周炎、牙周脓肿和牙髓感染以及伴发性全身性系统疾病密切相关〔5，6〕。病原菌致病是一个多因素共同作用的过程，有参与基本生理过程的看家基因和多种毒力基因参与。基因的多态性与复杂性使得其致病机制迄今尚不明了，已发现的的毒力因子包括菌毛、牙龈素、脂多糖（LPS）等〔7，8〕 PMNLs是机体免疫防御系