第七章基严因芯片.pptVIP

小鼠基因表达谱芯片(MGEC)?目前国内基因芯片常见品种.(上海博星公司) ;癌症相关基因表达谱芯片(CRGEC)?目前国内基因芯片常见品种.(上海博星公司) ;人类基因表达谱芯片(HGEC)?目前国内基因芯片常见品种.(上海博星公司) ;6400点的基因芯片 （面积 12X14 mm);核酸杂交技术 是基因芯片应用的基础。;基因芯片的基本原理;这5个亚序列依次错开一个碱基而重叠7个碱基。 亚序列中A、T、C、G 4个碱基自由组合而形成的所有可能的序列共有65536种。 假如只考虑完全互补的杂交，那么48个8 nt亚序列探针中，仅有上述5个能同靶DNA杂交。 可以用人工合成的已知序列的所有可能的n体寡核苷酸探针与一个未知的荧光标记DNA/RNA序列杂交，通过对杂交荧光信号检测，检出所有能与靶DNA杂交的寡核苷酸，从而推出靶DNA中的所有8 nt亚序列，最后由计算机对大量荧光信号的谱型（pattern）数据进行分析，重构靶DNA 的互补寡核苷酸序列。 ;原理 -- 通过杂交检测信息;基因芯片;;4. 基因芯片设计;确定芯片所要检测的目标对象 查询生物分子数据库 取得相应的DNA序列数据 序列对比分析 找出特征序列，作为芯片设计的参照序列。 数据库搜索 得到关于序列突变的信息及其它信息。 ;在进行探针设计和布局时必须考虑以下几个方面： (1)互补性 (2)敏感性和特异性 (3)容错性 (4)可靠性 (5)可控性 (6)可读性 ;２、DNA变异检测型芯片与基因表达型芯片的设计;３、cDNA芯片与寡核苷酸芯片的设计;４、寡核苷酸探针的优化设计;;基因芯片布局;5.基因芯片的制备;基因芯片使用步骤;基因芯片的制作方式;1、原位光蚀刻合成 ; 目前美国Affymetrix公司已有同时检测6,500个已知人类基因的DNA芯片，并且正在制备含500,000-1,000,000个寡核苷酸探针的人类基因检测芯片。该公司每月投入基因芯片研究的经费约100万美元。该产品不仅可用于基因表达分析和基因诊断等，而且在大规模药物开发方面也具有诱人的前景。 目前，用于分子诊断的DNA芯片不仅已可用于检测爱滋病病毒基因还可用于囊性纤维化（CF）、乳腺癌、卵巢癌等疾病相关基因的基因诊断。 鉴于光刻设备技术复杂，只能有专业化公司生产，加之成本高及合成效率不高的问题，因此有待进行以下研究：⑴对光刻技术进行改进，提高合成效率；⑵开发新的原位合成技术，如喷印合成技术，该技术既能进行原位合成又能进行非原位合成。;2、光导原位合成法;;3、原位喷印合成 ;4、点样法 ;玻璃片基的处理：使玻璃表面获得羟基、醛基、氨基等活性基团。 点样针沾取探针溶液。 点样针把探针点到玻片表面，让探针末端的化学集团与玻片表面的集团形成共价键。 针式点样的优缺点 优点：成本低，操作简单，密度高（几千-几十万点/cm2)， 转移过程中探针溶液损失小。 缺点：定量准确性、重现性不好;;? 生产商 Bio-Rad? 性能介绍 分辨率：1.25um(x，y轴)和0.25um(Z轴) ， 重复性：3um 球面精确性：l0um。一次制成芯片数：126块芯片 每块玻片点样量82,000个点;;喷墨点样的方式类似于喷墨打印机。将合成用探针溶液放入打印墨盒内，由电脑依据预定的程序在xyz方向自动控制打印喷头在芯片支持物上移动，并根据芯片不同位点探针序列需要将特定的探针试剂（不足纳升）喷印到特定位点。喷印上去的试剂即以固相合成原理与该处支持物发生偶联反应。;分子印章法;6.基因芯片样品制备 ;DNA芯片进行实验包括5个过程;1．样品制备。;2 样本采集过程关键点． ;离体新鲜组织，切成多个1cm3小块，剔除结缔组织和脂肪组织。胃、肠组织应剪除外膜；肝、肾、脾应剪除门部血管神经，肿瘤组织应将周围的正常组织切除干净（正常组织也应将周围的肿瘤组织切除干净）。 在RNase-Free 0.9％生理盐水中漂洗样品，以去除血渍和污物。 用铝箔包裹组织，或用5ml冻存管装载组织(但最好统一采用铝箔)。用记号笔在铝箔或冻存管外表写明样品编号，并贴上标签，迅速投入液氮冷却。 填写样品登记表，写明样品名称、种类、编号、取样日期、样品处理情况等将液氮冷却的组织放入样品袋（每个样品袋只保存同样的组织），袋口留一根编号绳，绳上粘一张标签纸（标签上注明：样品名称、编号、日期），迅速转入便携式液氮罐 保留1-2张取材部位的病理切片。; 以上步骤应在冰上进行且不超过15分钟，超过时间会导致样品的RNA降解。 对肿瘤组织的取材，要求尽可能准确地判定肿瘤和正常组织，例如对于手术切除的整个或