浅谈提取植物组织RNA的准备工作和操作规范.pdfVIP

浅谈提取RNA前的准备工作 1、提取RNA操作全程及配制RNA提取试剂必须穿实验服,戴口罩和一次性手 套,触摸皮 肤(例如面部)、门把手及实验室其他未处理过RNase 的普通物体表面后立即 更换手套。 2、器具干烤:需要干烤的器具包括金属和玻璃制品,如研钵、钥匙、镊子、剪 刀、试剂瓶 (200mL、500mL、1L)、量筒(50mL、100mL)、烧杯,即所有在配制RNA提取试 剂过程中需要用到的玻璃器皿均需要干烤处理。所有干烤的器具均用锡箔纸包住, 如研钵、钥匙、镊子、剪刀和匀浆器,容器用锡箔纸封口,如试剂瓶、量筒和烧杯。 180℃干烤6h后放入RNA专用柜中备用。 3、DEPC水的处理:用于处理枪头、试剂瓶盖和离心管等塑料制品的0.1%的 DEPC水可以在 烧杯中配制,磁力搅拌器上搅拌过夜,搅拌过程中用锡箔纸封口。用于配制 RNA提取试剂的DEPC水需要在干烤过的试剂瓶中配制,盖上瓶盖搅拌过夜后121℃ 灭菌20mi 。4、枪头、离心管和试剂瓶盖用0.1%DEPC水过夜处理后用报纸包好高 温灭菌,移液器必须 是专用的,用之前用DEPC处理的水配制的75%酒精擦拭整个移液器,特别是枪 杆。超净台的处理:用DEPC处理的水配制的75%酒精擦拭干净后,用氯仿快速擦拭, 再用75%酒精擦拭,将提取所需的物品放入超净台,并用75%酒精擦拭,另放置一个废 物缸,表面喷酒精,上述完成后,超净工作台紫外灯照射15-20mi 。试剂配制过程中 所用的枪头也必须是DEPC水处理过并高温灭菌的。 5、提取过程中用新开封的氯仿和异丙醇,用DEPC 水处理过的15mL 离心管分 装,每管分 装10mL 并于4℃保存,最后溶解RNA 沉淀的DEPC 处理过的水用处理过的 1.5mL 离心管分装并于-20℃保存。 6、用专用的电泳槽电泳RNA,用DEPC 处理的水配制50×TAE缓冲液,每次电 泳前用DEPC 处理的水配制1×TAE缓冲液进行电泳,电泳前用去污剂将电泳槽、制胶板和 梳子清洗干净,DEPC 水配制的75%乙醇擦拭,最后用DEPC 处理的水冲洗干净。 提取植物组织RNA 的操作步骤 1、将RNase-free 的离心管用镊子在超净台中取出并加入1mL trizol 置于冰 上,将新鲜采集 的植物幼叶用烘烤过的研钵在液氮环境下快速研磨成粉末,此过程中用到的剪 刀、钥匙和镊子均是经过烘烤处理的。研磨速度要快,一个样品尽量在1min 内研磨 完全,必须在液氮或低温下进行,将粉末加入trizol 中后迅速在震荡仪上振荡20s, 室温下放置5min。 2、加入200 μL 的氯仿,盖紧离心管盖,用手剧烈震摇30s,室温放置10min。 3、12000rpm,4℃离心15min,此时溶液分为三层,上层的水相,中间的DNA 沉 淀和下层 的有机相,小心缓慢吸取上层水相至新的离心管中,上清可以不用吸干净,但是 一定不要吸到中间层和下层。吸取上清的时候换新的手套。 4、加入等体积的异丙醇颠倒混匀后室温放置10min,12000rpm,4℃离心 10mi 。 5、小心地倒掉上清,用1mL 75%的乙醇洗涤沉淀。洗涤的过程可以用手指轻 弹离心管,尽 量将沉淀弹起,并上下颠倒,使整个离心管内部被充分洗涤。 6、12000rpm,4℃离心5min,重复洗涤一次,将上清液尽量吸干后室温干燥2- 3mi 。 7、加入20-50 μL DEPC 处理的水溶解RNA 沉淀。 8、用0.1%的琼脂糖凝胶电泳检测RNA 的完整性,200V 电泳10mi 。 9、RNA 的保存:电泳检测时先将RNA 溶液保存于-40℃,待电泳结束后根据实 验需要决定 是否保存RNA,若需保存则将样品先用液氮速冻后用封口袋装好,于封口袋上 标明日期和样品名称冻存于-80℃。 操作过程中的注意事项 1、研磨之前事先将研钵预冷,研磨过程中杵棒和研钵不要碰到其他未处理过 RNase 的物体。 在转移粉末至离心管中时速度一定要快,不能让粉末吸收空气中的水分而受潮, 以防止被空气中的RNase 降解。 2、在超净台中操作时每次需要用DEPC 水配制的75%酒精擦拭手及新放入超 净台中的物品, 操作过程中不能将皮肤任何地方暴露在超净台中。