生物检测技术多抗和单抗 .pptxVIP

生物检测技术多抗和单抗; 载体类型 ;;第二节、多克隆抗体(polyclonal antibody, PcAb) 将由多种抗原成分组成的抗原物质,采纳传统方法免疫接种实验动物后采集免疫血液,分离所得到的抗血清即为多克隆抗体。; 抗血清的制备是将制备好的免疫原依照一定的免疫程序接种给所选择的动物,该动物在含有多种抗原表位的抗原刺激下,体内多个B细胞克隆被激活并产生针对某一抗原多种不同表位的抗体,其混合物为多克隆抗体。;免疫血清的制备;能作免疫接种用的动物主要是哺乳类和禽类。兔、绵羊、豚鼠、鸡、山羊和马。 1、抗原与免疫动物种属差异越远越好。 2、动物必须适龄、健壮、无感染。 3、动物体内有与抗原相类似的物质或其它原因而使该抗原对该动物免疫原性极差,则该动物不能选用。例如:IgE–绵羊,胰岛素-家兔,酶类-山羊等。 4、抗血清的用量 5、抗血清的要求:例如,马型抗血清用于沉淀反应时较难掌握,因而极少应用。;常用的免疫动物; 3、免疫方案 ①全量免疫法:弗氏佐剂抗原多次注射 ②微量免疫法:卡介苗7天弗氏佐剂1月 抗原 ③混合免疫法:综合皮下、淋巴结和静脉;免疫间隔时间 第一次和第二次间隔10～20天,三次及以后间隔7～10天;;采集免疫血清前,要预先测试抗体效价测定,若效价达到要 求,应在末次免疫后一周及时采血,否则抗体效价会下降。 (1) 颈动脉采血法; 最常用的方法,家兔、山羊等动物 ; (2) 心脏采血法; 用于豚鼠、大鼠、鸡等小动物,要求操作熟练, (3) 静脉采血法;家兔可用耳中央静脉,山羊可用颈静脉; ;四、免疫血清的分离和保存;1、4℃保存:可保存3～6个月 2、低温保存:-20～-40℃,可保存2～3年 3、冰冻干燥保存:可保存3～5年;多抗的纯化与鉴定;盐析法(硫酸铵沉淀) 辛酸-硫酸铵沉淀法 离子交换法 亲和层析法 凝胶过滤法;1、盐析法(硫酸铵沉淀);主要步骤 在血清或腹水中加入硫酸铵使抗体沉淀; 4℃高速离心,弃上清,溶解沉淀; 可反复操作,逐级降低硫酸铵的浓度: 50%饱和度: 0、313g/ml 45%饱和度: 0、277g/ml 40%饱和度: 0、243g/ml 最后一次离心后,用少量PBS溶解沉淀,透析,测定浓度。;特点 成本低,步骤简单。 抗体的回收率比较高。 抗体纯度比较低,电泳后可见到明显的杂带,不适合于做各种标记。 需要高速离心机。;2、正辛酸-硫酸铵沉淀法;主要步骤: ①血清滤纸过滤去沉淀和脂质,滤液用4倍体积60mmo1/ L醋酸缓冲液(pH4、0)稀释后,用Na0H调,PH值至4、5。 ②逐滴加入辛酸(终浓度25u1/ml),室温h搅拌30分钟后,以6000-8000r/min、离心30分钟,收集上清液。 ③上清液经滤纸过滤2次,将滤液与10*PBS(0、lmol/L,pH7、4按10:1比例混合,调pH至7、4,置冰浴冷至40度。 ④每毫升上述混合液加0、2778固体硫酸钱,40度搅拌30分钟,以4000-6000r/min离心巧一20分钟,将沉淀溶于少量YBS,透析,测蛋白含量,冻存。;特点 成本较低,步骤较复杂。 抗体回收率特别低。 抗体纯度高,电泳后杂带特别少,适合于各种标记。 需要高速离心机,耐高速离心的玻璃离心管。;3、离子交换法;; NaCl Tris 梯度混合仪 ; ;主要步骤 先用硫酸铵沉淀抗体,粗提; 将样品过柱; 洗去没有结合的物质; 用梯度NaCl溶液洗脱,等量收集洗脱液; 紫外分光光度计测量,保留A280值明显升高的样品; 汇集样品,浓缩,测定浓度。;图3 在DEAE-纤维素上人血清蛋白的层析示意图 (M=IgM, G=IgG, A=IgA) ;特点 成本较低,步骤较简单。 抗体回收率较高。 抗体纯度较高,电泳后可见少量杂带,适合于各种标记。 纯化后抗体体积大,需要浓缩。 需要冷柜,自动收集器。;4、亲和层析法;;主要步骤 将Protein A与活化的柱子相结合(买商品柱); 将腹水或血清处理后过柱; 用结合缓冲液洗柱子,直到A280值为零; 用甘氨酸缓冲液洗脱抗体,等量收集洗脱液; 测定洗脱液的A280值,保留A280值明显升高的样品; 汇集样品,浓缩,测定浓度。; 葡萄球菌A蛋白 (staphylococcal protein A,SPA) 金黄色葡萄球菌细胞壁上的一种蛋白 分子量42000,等电点pH5、1 可与大多数动物Ig的Fc段结合 一个SPA分子