第六章基因操作中大分子的分离和分析讲课文档.pptVIP

Southern杂交流程图 样 品 制 备 电 泳 杂 交 转 膜 结果显示 探 针 制 备 现在九十四页，总共一百五十一页。 （一）Southern杂交的操作步骤 1.预处理： （1）用限制性内切酶将基因组DNA进行酶切。 （2）将酶切后的DNA片段进行琼脂糖凝胶电泳。 （3）将电泳出来的凝胶泡在强碱溶液中，此时双链的DNA样品变性成单链DNA结构。 （4）用酸中和，使单链DNA维持其单链状态 （5）大片段DNA脱嘌呤，0.2N HCl。 2.原位转移： 将凝胶上的单链DNA转移到尼龙膜或硝酸纤维素膜上。（毛细管、电转移、真空转移） 现在九十五页，总共一百五十一页。 现在九十六页，总共一百五十一页。 现在九十七页，总共一百五十一页。 现在九十八页，总共一百五十一页。 3.固定： 在真空烤箱里，80℃下烤1-3h或紫外线照射或微波烘烤，将核酸样品进一步固定在滤膜上。 4.杂交： 杂交之前须有一个预杂交，封阻膜的背景，避免杂交时背景吸附探针。（鱼精DNA或脱脂牛奶） 将滤膜移在含有放射性同位素标记的探针分子溶液中，溶液上的单链DNA分子与探针分子通过互补配对进行杂交，形成杂种分子。 现在九十九页，总共一百五十一页。 5.漂洗： 将滤膜上没有和单链DNA样品结合的游离的探针分子漂洗下来，此后滤膜上只有杂交分子。 6.放射自显影： 在X光曝射下进行放射自显影形成自显影图片。 7.比较鉴定： 将放射自显影图片上的谱带与凝胶上的谱带进行比较。确定与探针分子结合的DNA分子是凝胶上DNA链的那个片段。 现在一百页，总共一百五十一页。 放射自显影 DNA印迹转移 探针杂交 － ＋ 现在一百零一页，总共一百五十一页。 Southern Blotting的过程 1.碱变性的琼脂糖凝胶电泳分离的DNA 2.通过电泳液的移动转移胶中的DNA 3.固定胶中的DNA 4.预杂交和杂交(放射性和荧光检测) 5.结果检测 现在一百零二页，总共一百五十一页。 Southern印迹杂交方法操作简单，结果十分灵敏，在理想的条件下，应用放射性同位素标记的特异性探针和放射自显影技术，即使每带电泳条带仅含有2ng的DNA也能被清晰地检测出来。 Southern杂交主要用于判断某一生物样品中是否存在某一基因，以及该基因所在的限制性酶切片段的大小。（鉴定特定的目的基因） 现在一百零三页，总共一百五十一页。 现在一百零四页，总共一百五十一页。 现在一百零五页，总共一百五十一页。 1.硝酸纤维素滤膜 在印迹技术中，硝酸纤维素滤膜是目前应用最广的一种固相支持物，但它存在一些不足之处: （1）硝酸纤维素滤膜是依赖疏水性相互作用结合DNA的，这种结合并不十分牢固，随着杂交及洗膜进程，DNA会慢慢脱离硝酸纤维素滤膜，从而使杂交效率下降。 （二）Southern杂交的杂交滤膜 现在一百零六页，总共一百五十一页。 现在六十二页，总共一百五十一页。 1.5 脉冲电场凝胶电泳（pulsed-field gel electrophoresis, PEGE） 1984年，D.C.Schwartz和C.R.Cantor发明。用来分离整条染色体这样的超大分子量DNA分子，如大肠杆菌染色体基因组DNA，4000kb。DNA分子的迁移方向随所用电场方向的周期性变化而不断改变。可成功分离到分子量高达107bp的DNA大分子。 现在六十三页，总共一百五十一页。 脉冲场凝胶电泳实际上是一种交替变化电场方向的电泳，以一定的角度并以一定的时间变换电场方向，使DNA分子在微观上按“Z”字形向前泳动，从而到达分离大分子DNA的目的。 与常规的直流单向电场凝胶电泳不同，这项技术采用定时改变电场方向的交变电源，每次电流方向改变后持续1秒到5分钟左右，然后再改变电流方向，反复循环，所以称之为脉冲式交变电场。 脉冲场凝胶电泳的工作方式：横向交变电泳（TAFE）、场翻转凝胶电泳（FIGE）、旋转凝胶电泳和箝位匀场电泳（CHEF）。其中使用最广泛的是CHEF。 现在六十四页，总共一百五十一页。 + + + - - - - - 2 现在六十五页，总共一百五十一页。 现在六十六页，总共一百五十一页。 现在六十七页，总共一百五十一页。 现在六十八页，总共一百五十一页。 脉冲电泳槽 电泳仪 冷凝器 真空泵 BIio-Rad公司CHEF-DR脉冲电泳仪 现在六十九页，总共一百五十一页。 影响脉冲场凝胶电泳的因素：脉冲时间、分子大小、电场强度、温度和电场间角度。 若分子重新定向时间和脉冲时间的