重组人肠激酶纯化方案.pdfVIP

重组人肠激酶纯化方案 一、设计背景 肠激酶是存在于哺乳动物十二指肠内的一种异源二聚体丝氨酸蛋白酶。分子质量为 150ku 1 115ku 1 35ku pH 4.5 9.5 4 45 ，由 条 重链和 条 轻链组成，在 值 ～ 、温度 ～ ℃范围 内特异性水解蛋白底物。 1 1 1 天然肠激酶由 条结构亚基 （重链）和 条催化弧基 （轻链）构成，两者通过 个分 子间二硫键结合，结构亚基负责将催化亚基固定在小肠刷状缘膜上并引导它向肠腔移动， 催化亚基可以特异性识别Asp-Asp-Asp-Asp-Lys序列并沿序列的羧基端切下，由于经BEK N- （即重组人肠激酶）裂解融蛋白所释放的目的多肽具有和野生型完全一致的 末端氨基 酸序列，因而可作为蛋白表达体系中融合蛋白的切割试剂。如将胰蛋白酶原活化为胰蛋白 酶，从而启动各种酶原活化的级联。 目前化工生产一般用稀酸法提取，此法的缺点是天然的肠激酶来源有限，并且提取分 离的成本高，加之天然提取的肠激酶易为其它蛋白酶污染，造成切割融合蛋白的同时又降 解了目的产物。 而基因工程的方法具有低成本高纯度且易分离低污染的特点，因而运用基因工程的方法生 产肠激酶广为应用。 二、设计依据 金属鳌合亲和层析介质，又称固定金属离子亲和色谱，其原理是利用蛋白质表面的 Cu z.n,Ni co Fe 一些氨基酸，如组氨酸能与多种过渡金属离子如 ， ， ， 发生特殊的相 互作用，能够吸附富含这类氨基酸的蛋白质，从而达到分离纯化的目的。因此，偶联这 些金属离子的琼脂糖凝胶就能够选择性地分离出这些含有多个组氨酸的蛋白以及对金属 离子有吸附作用的多肽、蛋白和核苷酸。半胱氨酸和色氨酸也能与固定金属离子结合， 但这种结合力要远小于组氨酸残基与金属离子的结合力。 镍NTA亲和层析介质(Ni-NTA）具有特异性好、流速快的优点，颗粒粒度均匀，粒径 小，并且鳌合镍更稳定，能耐受更高的还原剂，物理和化学稳定性好，批次重复性好。 本产品已经螯合好镍离子，使用更方便。 与大多蛋白的分离纯化方法类似，重组人肠激酶 （BEK）可通过硫酸铵沉淀、DEAE 柱、凝胶层析和透析等方法得到纯品。另外，运用组氨酸 (Histidine,His) 在蛋白末端进 行标记，使用Nickel金属螯合柱亲和纯化这种低成本高效率一步分离蛋白的方法，也正广 泛地运用到BEK的分离纯化。本方案依据蛋白质与金属离子亲和的原理设计了一种使用 Ni2+螯合亲和层析填料纯化BEK的方案。 三、提取方案 （一）材料、试剂与仪器设备 1.材料与试剂 物料名称 级别 生产商 EDTA AR 西陇科学 氢氧化钠 AR 西陇科学 Ni 6FF （IDA） N/A 汇研生物 Tris AR 麦克林 氯化钠 AR 广东光华 咪唑 AR 麦克林 西陇科学 磷酸二氢钠 AR