重庆大学学生实验报告[1]改.docxVIP

重庆大学学生实验报告[1]改 重庆大学研究生专业实验教学 实验报告 实验课程名称：实验指导教师：学院：专业及类别：学号：姓名：实验日期：成绩： 细胞机械加载实验技术 吕永钢 生物工程学院 生物医学工程（学术型） 20221902047刘h2022三点二七 重庆大学研究生院制 一、 实验目的 ⒈学习细胞力学加载的基本原理及相关知识⒉熟悉flexercell-4000操作流程和注意事项 二、 实验仪器和设备 材料：培养瓶，试管，移液管，废液缸，75％酒精棉球，酒精灯，前交叉韧带 （ACL）细胞。 仪器：flexercell-4000基底加载装置，c02培养箱，倒置显微镜，超净台，恒温 水浴锅，4℃冰箱。 试剂：dmem培养基，小牛血清或胎牛血清，0.25％胰蛋白酶，pbs缓冲液。 三、 实验原理 （1） 基板变形加载技术 基底形变加载技术是用弹性膜作为基底材料，通过机械拉伸或利用气压，液压和机械接触引起弹性底面的形变，通过对基底材料加载后使基底材料的应变传递到细胞上,使附着于该底面的细胞受到牵引力，并可附加一些调节力周期的机械装置。通过该方式可产生循环或静止的单轴拉伸、循环或静止的双轴拉伸、循环或静止的等双轴拉伸。 （2） flexercell-4000的实验原理 flexercell-4000基底加载装置，本实验采用美国flexercell公司生产的细胞柔性基底加载装置（flexercell-4000tension），图1为其结构简图该系统是通过一个真空泵抽吸特制的柔性细胞培养膜，形成负压而使培养膜产生拉伸应变，从而使黏附生长的细胞受到张力的作用。细胞所受力的大小正比于培养膜的牵拉幅度即应变率（%），整个加载装置放置于co2孵箱内，加载程序由flexercell-4000计算机软件自动控制。 一 flexercell4000柔性基底拉伸系统的组成： ① FlexCell-4000软件的Flexcentral② 负压输出控制（flexlink），真空源负压泵 ③真空基底板（baseplateandgasket），密封垫，加载平台 ④ BIOflex培养板BIOflex培养板是一次性的，六孔板的硅胶膜涂有不同的 的蛋白质或氨基酸。如胶原蛋白（collagen），弹性蛋白（elastin）等 图1 flexercell-4000的简单结构图 该系统用真空负压对生长中的细胞（组织）进行加载，加控制的静力或动力循环使膜变形，从而是贴在膜上生长的细胞（组织）也发生相应的变形，诱发细胞(组织)发生生物学变化。当只有bioflex培养板时，基膜最大伸长可达到30%，有bioflex培养板和加载台时，基膜的伸长可过20%。可以使用flexercell拉伸加载系统进行试验的细胞或组织有很多，例如：肌肉、心肌、血管、肌腱、韧带、骨和软骨等。 Flexercell-4000柔性基板拉伸系统由Flexercell-4000计算机软件自动控制，以应用不同的刺激参数。可设置的参数如下： 1.培养板膜的最小和最大伸长率（0-30%）2.频率 3.加载波形：静态加载、正波、心形波、三角波、方波、自定义波形 2 四、 实验内容 1．人无菌室之前用肥皂洗手，用75％酒精擦拭消毒双手。2．超净台台面应整洁，用0.1％新洁尔灭溶液擦净。4．打开超净台的紫外灯照射台面20min左右。 5.将类风湿性关节炎（RA）的成纤维细胞样滑膜细胞接种到flexercell-4000基础加载装置中 置特用的六孔板上，把六孔板置入flexercell-4000配套的co2培养箱进行培养，于孵箱内培养48h。 6.加载前，用2%低血清新鲜培养基替换培养板中的旧培养基。从每个孔中随机拍摄一些照片。7.在flexcercell4000软件上选择如下参数：正弦波，最小值：0，最大值：12%，时间：12h。 8．打开缓冲泵后，打开真空泵，然后启动加载。 9.加载后，关闭充气泵，然后关闭缓冲泵，然后关闭计算机。10.卸料后继续培养24小时，每口井随机拍照。 具体设备使用步骤： 1） 打开应力加载控制器和计算机 2）、开启flexsoftfx-4000软件，命名和设置参数 3） 将装有细胞的细胞培养板放在应力加载平台上，盖紧，关闭培养箱。4） 打开气阀装置。先打开泵管，然后打开阀门（5）。单击“开始”运行软件 6）、运行软件过程中，