Cre-loxP、CRISPR-Cas9技术与病毒载体在基因敲除中的联用.pptVIP

4 组合应用示例——Cre-loxP与病毒工具结合 * “条件性基因激活”模式 4.1 Cre-loxP与病毒工具结合应用 * 4.1 Cre-loxP与病毒工具结合应用 * B 4.2 Cas9系统与病毒工具结合应用 * 4.2 Cas9系统与病毒工具结合应用 * 4.3 Cre-loxP、CRISPR-Cas9与病毒结合应用 Cre-dependent Cas9 mice * 思考题 阐述Cre-LoxP技术的基本原理和程序。 CRISPR-Cas9技术与ZFN、TALEN相比均有哪些优势？ 举例说明CRISPR-Cas9技术与病毒工具的组合应用。 * * * * * LoxP位点，是locus of X-overP1的缩写，是位于P1噬菌体中的34bp序列，由两个13bp的反向回文序列和8bp的中间间隔序列共同组成，间隔序列决定loxP的方向，loxP位点的序列如下所示： 13bp???????????? 8bp????????????13bp ATAACTTCGTATA-NNNTANNN-TATACGAAGTTAT Cre重组酶不仅具有催化活性，而且与限制酶相似，能识别特异的DNA 序列，即loxP位点，使两个loxP位点间发生基因重组。Cre重组酶无需借助任何辅助因子，可作用于多种结构的DNA底物，如线形、环状甚至超螺旋DNA。 * * * * 传统的基因打靶技术主要依赖于基因同源重组，利用设计的同源臂替代靶基因片段，从而达到基因敲除的目的，但是同源重组在细胞中的发生概率极低，而且步骤比较复杂、耗时间、费用也比较高。 近几年出现了很多新型基因组编辑工具，如锌指核酸酶（zinc finger nucleases，ZFN）、类转录激活因子效应物核酸酶（Transcription activator-like effector nuclease，TALEN）以及CRISPR-Cas9技术。利用ZFN、TALEN以及CRISPR-Cas9技术可以在特定位点产生基因组双链DNA断裂（double-strand breaks，DSB），通过非同源末端连接（non homologous end joining, NHEJ）诱发DNA的错误修复，进而形成各种基因大段删除或重排。其中，CRISPR-Cas9技术由于构建简单、成本低、效率高等特点，自发明以来，迅速被研究人员广泛应用于各类科学研究中，成为了当今生命科学研究的热门技术。 作为最新最“火”的基因组编辑技术，CRISPR-Cas9技术被评为2013年生物学十大突破，2014年值得关注的技术。该技术的发明者之一，麻省理工大学的张锋教授2013年被Nature杂志评为十大人物。 * * CRISPR/Cas系统最早是在细菌的获得性免疫系统中发现的。规律性重复短回文序列簇 (clustered regularly interspaced short palindromic repeats, CRISPRs) 是一类独特的DNA规律性重复序列，存在于大多数的细菌和古细菌中。通常在临近CRISPR的区域还包含一组保守的蛋白质编码基因，被称为Cas（CRISPR-associated）基因，其编码的蛋白质包括核酸酶、聚合酶、解旋酶，具有与核糖核酸结合的功能。这些Cas蛋白与CRISPR转录出的RNA结合形成核糖核蛋白复合物，在原核生物中发挥着获得性免疫功能，使宿主获得抵抗噬菌体、质粒等外来DNA入侵的免疫能力。一般来说，当外源DNA片段入侵后，宿主会捕获一段20bp左右的DNA片段（被称为protospacer），将其插入到自身的基因组中，形成CRISPR区域，在Type II CRISPR-Cas系统中，主要由Cas9蛋白、反式激活 crRNA（trans-activating crRNA, tracrRNA）和 CRISPR-derived RNA（crRNA）组成。CRISPR区域首先转录成前体RNA（pre-crRNA），在Cas9蛋白的参与下加工成一段含保守重复序列和间隔区的成熟crRNA，同时，tracrRNA也会被转录并和crRNA形成一种双链的RNA结构，然后与Cas9蛋白组成具有DNA内切酶活性的复合物。该复合物在crRNA的引导下，由Cas9蛋白的核酸结构域对外源D