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木犀草苷人工抗原合成及免疫原性鉴定 目录 TOC \o 1-9 \h \z \u 目录 1 正文 1 文1：木犀草苷人工抗原合成及免疫原性鉴定 1 2方法和结果 3 文2：姜黄素类化合物的合成及抗肿瘤活性 7 1 合成实验 8 2 活性实验 10 2．2 体外抗肿瘤实验 11 2．3 琼脂糖凝胶电泳实验 11 2．4 细胞形态学观察 11 3 讨 论 12 参考文摘引言： 12 原创性声明（模板） 13 文章致谢（模板） 13 正文 木犀草苷人工抗原合成及免疫原性鉴定 文1：木犀草苷人工抗原合成及免疫原性鉴定 金银花LoniceraeJaponicaeFlos为忍冬科植物忍冬LonicerajaponicaThunb.的干燥花蕾或带初开的花，具有清热解毒，疏散风热之功效，是常用中药材之一。近些年来随着金银花市场需求量的增加，经济价值的升高，出现了各种质量问题。木犀草苷（luteoloside，LG，图1）又称木犀草素-7-O-β-葡萄糖苷（luteolin-7-O-β-glucoside）、青兰苷（cynaroside），属黄酮苷类化合物，具有抑菌、抗菌、抗炎、抗氧化、抗肿瘤[1]、抗诱变[2]、平喘[3]、治疗糖尿病[4]、创伤修复[5]等多种药理活性，广泛分布于多种药用植物中[6～8]。2010年版《中国药典》[9]以木犀草苷作为金银花质量控制指标性化学成分之一。 目前，木犀草苷的检测方法有薄层色谱法[10]、高效液相色谱法[11]、液质联用技术[12]、近红外光谱检测法[13]、毛细管电泳技术[14]等。王永慧等[10]以乙酸乙酯-丙酮-甲酸-水（7∶3∶1∶）为展开剂，喷以5%三氯化铝乙醇溶液置365nm紫外灯下可定性检测木犀草苷。高效液相色谱法是木犀草苷最常用的检测方法，其优势在于检测灵敏度高、精密度高、重复性好，但液相检测范围通常在微克级别，而药材中木犀草苷的含量差异较大，有时灵敏度受限，液相色谱通量低，且不同色谱柱、不同仪器需要重新筛选色谱条件，方法耐用性差[15]。液质联用技术虽然灵敏度高、分离度好，但样品前处理复杂，仪器设备昂贵，检测成本高，难以推广普及。建立一种操作简便、快速、高灵敏度、高通量的木犀草苷检测方法对金银花质量控制具有重要意义。 酶联免疫吸附检测技术（ELISA）是将抗原抗体的特异性结合反应与酶的高效催化作用相结合，实现对抗原或抗体的定性定量检测，具有特异性强、灵敏度高、操作简便、高通量、检测成本低廉、适用于现场监控等优势，在农学、医学、兽医学、食品安全检测、环境污染检测等领域应用广泛，近些年也逐渐应用于中药研究领域，如中药有效成分[16]和有毒成分[17]的检测等，有望成为中药质量控制的新技术之一。 本实验以木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷（图1）为原料，经活泼酯法[16]合成木犀草苷完全抗原，以免疫原（LG-BSA）免疫Balb/c小鼠，获得了高效价特异性血清，为制备木犀草苷单克隆抗体及建立特异性ELISA检测方法提供了基础。 1材料 实验动物为6～8周Balb/c雌性小鼠（中国军事医学科学院实验动物所）；牛血清白蛋白（BSA）、鸡卵清白蛋白（OVA）；N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）、N，N′-二环己基碳二亚胺（DCC）、HRP标记山羊抗小鼠IgG、弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂（Sigma公司）；木犀草苷（110753-201314，纯度%，中国食品药品检定研究院；木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷（111968-201301，纯度%，中国食品药品检定研究院）；其他试剂为分析纯。 酶免疫检测仪（MULTISKANMK3，Thermo）；紫外-可见分光光度计（UNICO4802，尤尼柯上海有限公司） 包被缓冲液：·L-1碳酸盐缓冲液（）；PBS：含%的·L-1磷酸盐缓冲液（）；PBST：含%Tween-20的PBS；PBSTG：含%明胶的PBST；底物缓冲液：·L-1Na3PO4和·L-1的Na2HPO4（）；显色液：10mL底物缓冲液中加入20mg邻苯二胺（OPD）和4μLH2O2；终止液：2mol·L-1H2SO4。 2方法和结果 免疫抗原及包被抗原的合成称取木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷标准品，溶解于1mL无水N，N-二甲基甲酰胺中，常温下磁力搅拌。加入羟基琥珀酰亚胺，避光搅拌反应30min后，加入二环己基碳二亚胺，4℃搅拌反应4h，离心（3000×g，5min），取上清。将20mgBSA/OVA溶解于2mLPBS溶液中，将离心后的上清液逐滴加入到蛋白质溶液中，4℃搅拌反应12h后，装入透析袋，PBS透析2d，每6h换1次透析液。透析后得免疫原及包被抗原，然后分装，-40℃冷冻，备用。　半抗