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雷公藤MCT基因的全长克隆与表达分析 目录 TOC \o 1-9 \h \z \u 目录 1 正文 1 文1：雷公藤MCT基因的全长克隆与表达分析 1 文2：地黄酪氨酸脱羧酶基因的克隆与表达分析 7 1 材料和方法 8 2 结果与分析 10 3 讨论 13 参考文摘引言： 14 原创性声明（模板） 15 文章致谢（模板） 15 正文 雷公藤MCT基因的全长克隆与表达分析 文1：雷公藤MCT基因的全长克隆与表达分析 ，味苦，性寒，有大毒；具有祛风湿，活血通络，消肿止痛，杀虫的功效[1]。雷公藤主要有效成分为倍半萜类生物碱，二萜类，如雷公藤甲素，雷公藤红素，雷公藤碱[2]。现代药理研究表明，雷公藤甲素具有抑制细胞增殖作用，对胰腺癌[3]、乳腺癌[4]、结肠癌[5]等均有良好的抗肿瘤活性。 在植物体内，萜类化合物是由位于细胞质的甲羟戊酸途径（MVA）和位于质体的非甲羟戊酸途径（MEP）合成。2-C-甲基-D-赤藻醇-4-磷酸胱氨酰转移酶（2-C-methyl-D-erythritol4-phosphatecytidylyltraferase，MCT或MECT，IspD）是MEP途径中重要的关键酶，催化2-C-甲基-D-赤藓醇-4-磷酸（MEP）生成4-（5-焦磷酸胞苷）-2-C-甲基-D-赤藓醇（CDP-ME）。目前已经从银杏[6]，拟南芥[7]，胡黄连[8]，杜仲[9]等植物中克隆得到编码MCT的基因。 本研究以雷公藤悬浮细胞为材料，从中克隆得到了全长1318bp的TwMCTcDNA序列，然后利用生物信息学分析核酸序列和氨基酸序列的同源性，进化关系；同时，利用实时荧光定量PCR检测MeJA诱导雷公藤悬浮细胞TwMCT基因的表达水平，为进一步研究雷公藤甲素类成分次生代谢调控和生物合成提供基因元件。 1材料 仪器VeritiTM96孔梯度PCR仪（ABI公司），TF7500型RealTimePCystem（ABI公司），5810R型低温冷冻离心机（Eppendorf公司），MM400型混合型球磨仪（Retsch公司），ND-100型核酸蛋白分析仪（Gene公司），DYY-12型电脑三恒多用电泳仪（北京市六一仪器厂），GBOXHR型紫外凝胶成像分析仪（Syngene公司） 试剂SMARTerTMRACEcDNAAmplificationKit（Clontech公司）；ExTaq，PrimeSTARGXLDNAPolymerase，SYbrPremixExTaq，均购自Takara公司；KAPASYbrFASTqPCRKitMasterMix（Kapa公司）；GeneJETGelExtractionKit购自Thermo公司；Tra5α感受态细胞，pEASY-T3克隆载体均购自北京全式金生物技术有限公司；RNA纯化试剂盒和QuantcDNA第一链合成试剂盒购自天根生化科技有限公司。 样品本实验所用雷公藤悬浮细胞，无菌苗等组织[10]由首都医科大学分子生药与中药资源实验室继代保存。 2方法 ～，液氮环境下粉碎，采用改良CTAB法（2×CTABBuffer-2%CTAB；100mmol·L-1Tris-HCl（）；25mmol·L-1EDTA；·L-1NaCl；·L-1亚精胺）提取所有样品的总RNA；参照RNA纯化试剂盒说明书，对RNA进行纯化精制。通过琼脂糖凝胶电泳和核酸蛋白分析仪检测RNA质量。 全长克隆以总RNA为模板，参照SMARTerTMRACEcDNAAmplificationKit说明书，进行反转录，合成RACEReady第一链cDNA。调取雷公藤转录组中TwMCT基因数据，在NCBIcDNA文库中进行Blastx比对分析，设计全长扩增特异性引物（表1）。以RACEReady第一链cDNA为模板，在VeritiTM96孔梯度PCR仪上进行全长PCR扩增。反应体系包括10μL5×PrimeTARGXLbuffer，4μLdNTP（·L-1），1μL引物（10×），1μLPrimeTARGXLDNAPolymerase，1μLDNA模板（约15ngcDNA），ddH2O补足到50μL。PCR反应条件为98℃3min；98℃10s，60℃15s，68℃1min30s，35个循环；68℃5min。PCR产物回收后，连接pEASY-T3克隆载体，然后转化大肠杆菌感受态Tra5α，挑取单克隆菌落，经菌液PCR扩增初步鉴定后送测序验证，获得TwMCT全长cDNA。 基因的生物信息学分析在NCBI蛋白质和核苷酸数据库中搜索MCT序列，比较TwMCT与其他物种同源性。使用ORFFinder（http：/projects/gorf/）查找开放阅读框。在常用生物信息学分析软件上分析TwMCT序