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小麦总RＮA的小量快速提取 目录 TOC \o 1-9 \h \z \u 目录 1 正文 1 文1：小麦总RＮA的小量快速提取 1 文2：微波法快速提取丝状真菌基因组DNA 6 1 材料与方法 7 (1)菌种 见表1。 7 2 结果与讨论 9 参考文摘引言： 10 原创性声明（模板） 11 文章致谢（模板） 11 正文 小麦总RＮA的小量快速提取 文1：小麦总RＮA的小量快速提取 高质量ＲＮＡ的提取是分子生物学研究的重要一环，直接影响ｃＤＮＡ文库的构建、基因克隆以及表达分析等。小麦是重要的农作物，其ＲＮＡ提取方法较多［１－５］。尽管这些方法提取的ＲＮＡ质量较好，但都要使用液氮，提高了试验成本。本研究采用ＣＴＡＢ和尿素法分别提取小麦幼苗的根、茎和叶组织的总ＲＮＡ，为小麦总ＲＮＡ的提取提供了一条新途径。 １ 材料与方法 １．１植物材料 小麦杂交品种郑麦９０２３购于荆州市农资大市场，播种于温室，在苗期分别取根、茎和叶组织用于ＲＮＡ的提取。 １．２方法 １．２．１ＲＮＡ提取液成分ＣＴＡＢ法ＲＮＡ提取液成分：２０ ｇ／Ｌ ＣＴＡＢ，２０ ｇ／Ｌ ＰＶＰ，１００ ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ值 ８．０），２５ ｍｍｏｌ／Ｌ Ｎａ２ＥＤＴＡ（ｐＨ值８．０），２．０ ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ，混匀灭菌，用前每１００ ｍＬ提取液加入２ ｍＬ ２－巯基乙醇。 尿素法ＲＮＡ提取液成分：７ ｍｏｌ／Ｌ 尿素，５０ ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ－HＣｌ（ｐＨ值８．０），１０ ｍｍｏｌ／Ｌ Ｎａ２ＥＤＴＡ（ｐＨ值８．０），３．５ ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ，１ ｇ／Ｌ ＳＤＳ。 １．２．２ＲＮａｓｅ灭活离心管和移液器吸头用１ ｍＬ／Ｌ ＤＥＰＣ水浸泡２４ ｈ；研钵等用少量的无水乙醇灼烧，然后用锡箔纸包装；Ｔｒｉｓ试剂用灭菌的１ ｍＬ／Ｌ ＤＥＰＣ水配制，其他试剂均用未灭菌的１ ｍＬ／Ｌ ＤＥＰＣ水配制；最后，将以上所有试剂或物品高压灭菌４０ ｍｉｎ。 １．２．３尿素法提取ＲＮ Ａ步骤①取０．２ ｇ材料，加入研钵中，加入２ ｍＬ提取液，迅速充分研磨；②快速分装到两支１．５ ｍＬ的离心管中，于４℃、１２ ０００ ｒ／ｍｉｎ离心１５ ｍｉｎ；③取上清液，加１／３体积的３ ｍｏｌ／Ｌ ＮａＡc（ｐＨ值５．３），１／５体积的氯仿／异戊醇（２４∶１），混匀后冰浴２０ ｍｉｎ；④于４℃、１２ ０００ ｒ／ｍｉｎ离心１５ ｍｉｎ；⑤取上清液加入等体积冰浴冷却的异丙醇，冰浴１０ ｍｉｎ；⑥于４℃、５ ０００ ｒ／ｍｉｎ离心１０ ｍｉｎ；⑦沉淀溶于５ ｍＬ含有１ｇ／Ｌ ＳＤＳ的ＴＥ缓冲液中，加入８ ｍｏｌ/Ｌ ＬｉＣｌ至终浓度２．５ ｍｏｌ/Ｌ，冰浴３ ｈ；⑧于４℃、１２ ０００ ｒ／ｍｉｎ离心１０ ｍｉｎ；⑨７０％（Ｖ／Ｖ）乙醇洗涤沉淀两次，空气干燥后溶于ＤＥＰＣ处理水中，保存于－７０℃冰箱中备用。 １．２．４ＣＴＡＢ法提取ＲＮＡ步骤①将提取液置于６５℃水浴锅中温浴３０ ｍｉｎ，将研钵放在烘箱中低温烘热；②取０．２ ｇ材料于研钵中，加入２ ｍＬ提取液，迅速充分研磨，然后快速分装到两个１．５ ｍＬ离心管中，轻轻混匀，置于６５℃水浴锅中１０ ｍｉｎ；③加入等体积的氯仿／异戊醇，混匀后在４℃，１２ ０００ ｒ／ｍｉｎ条件下离心１０ ｍｉｎ，吸取上清液；④重复上述步骤，并在合并的上清液中加入１／４体积的８ ｍｏｌ/Ｌ ＬｉＣｌ溶液并混匀，４℃过夜；⑤４℃ １０ ０００ ｒ／ｍｉｎ离心２０ ｍｉｎ，弃上清液；⑥加入５０ μＬ的灭菌ＤＥＰＣ水溶解ＲＮＡ，再加入１／１０ 体积的３ ｍｏｌ／Ｌ ＮａＡｃ和２倍体积的无水乙醇，于－７０℃放置３０ ｍｉｎ；⑦于４℃、 １２ ０００ ｒ／ｍｉｎ离心 ２０ ｍｉｎ，弃上清液，用７０％（V/V）的乙醇清洗沉淀，吹干后加入３０ μＬ的灭菌ＤＥＰＣ水溶解，保存于－２０℃冰箱中备用。 １．２．５总ＲＮＡ完整性检测 １） 琼脂糖凝胶电泳检测：电泳槽用１ ｍＬ／Ｌ ＤＥＰＣ水浸泡２４ ｈ，用１×ＭＯＰＳ作为电泳缓冲液。取２ μＬ ＲＮＡ溶液于１０ ｇ／Ｌ琼脂糖凝胶电泳检测，电压为９０Ｖ。 ２）紫外分光光度计检测：取４ μＬ ＲＮＡ溶液，用分光光度计测定Ａ２６０和Ａ２８０的值。每种组织取３份ＲＮＡ溶液样品，求平均值。 ３）ＲＴ －ＰＣＲ分析：使用Ｐｒｏｍega ｃＤＮＡ第一链合成试剂盒，合成ｃＤＮＡ第一链。反应完成后，将合成产物稀释５倍，取１ μＬ用于ＲＴ－ＰＣＲ的模板ｃＤＮＡ。根据小麦ａｃｔｉｎ基因（ＡＢ１８１９９１）设计１对引物，左引物为：５′ ＣＡＡＧＧＣＧＧＡＧＴＡＣＧＡＴＧＡＧＴ ３′，右引物为：５′ ＴＴＧＴＧＣＣＡＡＡＡＧＧＡＡＡＡＧＣＴ ３′。ＲＴ－ＰＣＲ反应体系为 ２５ μＬ：即１０×Ｔａｑ