制备鉴定H5N1禽流感病毒PB1F2特异性单克隆抗体.docVIP

制备鉴定H5N1禽流感病毒PB1F2特异性单克隆抗体 目录 TOC \o 1-9 \h \z \u 目录 1 正文 1 文1：制备鉴定H5N1禽流感病毒PB1F2特异性单克隆抗体 1 1、材料与方法 3 2、结果 6 3、讨论 9 文2：抗禽流感病毒M2蛋白单克隆抗体的制备及鉴定 10 1 材料和方法 11 10000 min离心10 min。吸取上清冷冻保存。 14 2 结果 15 3 讨论 17 参考文摘引言： 19 原创性声明（模板） 20 文章致谢（模板） 20 正文 制备鉴定H5N1禽流感病毒PB1F2特异性单克隆抗体 文1：制备鉴定H5N1禽流感病毒PB1F2特异性单克隆抗体 禽流感病毒属于正黏病毒科的A型流感病毒属，主要在家禽及野生鸟类中传播。高致病性禽流感不仅对家禽养殖业造成了巨大的经济损失，而且对人类和动物健康也构成了持续性威胁。禽流感病毒亚型众多，变异速度快，能够持续不断地跨种间传播感染人类，目前感染人类的禽流感病毒亚型已超过10多种，如H5N1、H7N9和H9N2这些具有重要公共卫生学意义的亚型。截止至2018年底，WHO已报道860例人高致病性H5N1禽流感病毒确诊病例[1]。在同一时间范围内，数百万家禽因感染H5N1AIV而被扑杀或死亡，造成了相当大的经济损失[2]。禽流感病毒的基因组由8个独立的负链RNA片段组成，它们编码至少17种质(PB1、PB2和PA)、非结构蛋白质(1)和核输出蛋白(NEP/2)[3];7种辅助蛋白包括PB1-F2、PB1-N40、PA-X、PA-N155、PA-N182、M42和3蛋白。 PB1-F2蛋白是2001年被发现的第1个辅助蛋白，是由PB1基因的第2个阅读框编码的一种非结构蛋白[4，5]。除了翻译模式外，PB1-F2还有几个独特的特点[6]:在感染细胞中快速降解、线粒体定位、形成非选择性离子通道[7，8，9]，以及促凋亡特性[10]。PB1-F2除了诱导免疫细胞凋亡以外，诸多研究表明它可引起多种效应，与病毒的致病力密切相关，如上调病毒聚合酶活性，诱导炎症反应而导致继发细菌性肺炎，抑制干扰素反应等[11，12]。PB1-F2的线粒体靶向序列位于其羧基端，该区域为富含两亲性的α-螺旋精氨酸序列，而63-75位氨基酸被证明是PB1-F2定位于线粒体所必需的。 在AIV感染过程中，能刺激宿主产生针对结构蛋白(HA、NA、NP、2、M1和M2)和非结构蛋白(1)的抗体，只有针对HA的抗体能有效中和病毒[3]。抗PB1-F2蛋白的抗体是针对A型流感病毒感染产生的特异性抗体，通过免疫沉淀和免疫荧光试验已经证实可以在免疫小鼠和人类恢复期血清中检测到PB1-F2特异性抗体[13]。近年来有研究表明，针对PB1-F2C末端的特异性抗体可有效保护小鼠免受AIV感染，而针对PB1-F2N末端蛋白的特异性抗体对病毒感染无显著作用[10] 本研究旨在采用原核表达系统表达并纯化cPB1-F2羧基末端蛋白，并结合杂交瘤技术制备H5N1禽流感病毒cPB1-F2特异性单克隆抗体，为进一步明确抗PB1-F2特异性抗体在AIV感染中的生物学功能，以及为禽流感病毒抗体药物研发和致病机制研究积累资料。 1、材料与方法 材料 、菌株及质粒 人肺癌细胞A549、大肠埃希菌DH5α及Rosetta(BL21)感受态、pGBKT7-PB1(H5N1)、pCAGGS-cPB1-F2(38-87aa)等，均由吉林大学动物医学学院人兽共患病研究所病毒实验室保存。 胎牛血清、胰酶、RPMI1640及DMEM培养基，Hyclone公司产品;T4DNA连接酶、DNAMarker、限制性内切酶、TMB试剂、AlexaFluor488荧光标记的抗体和抗体亚类鉴定试剂盒、BCA蛋白定量试剂盒及ECL化学发光试剂盒，Thermo公司产品;PEG融合剂、50×HAT培养基、50×HT培养基，为Sigma公司产品;胶回收试剂盒和质粒小提试剂盒，OMEGA公司产品;胰蛋白胨、酵母提取物和琼脂粉，青岛海博生物技术有限公司产品;Balb/c小鼠，购自长春市亿斯实验动物技术有限公司。 PCR仪(K960型)，杭州晶格科学仪器有限公司产品;凝胶图像分析仪(X-press型)，法国VilberIourmat公司产品;稳压稳流电泳仪(DYY-6B型)，北京市六一仪器厂产品;微量离心机(Pico-17型)，美国Thermo公司产品;高压灭菌锅(HVE-50型)，日本Hirayama公司产品;纯水机(UNIQUE-R20型)，厦门锐思捷科学仪器有限公司产品;台式恒温振荡器(IS-RDD3型)，美国精骐有限公司产品;电热恒温水槽(DK-8D型)，上海一恒科学仪器有限公司产品;p