光密度定量蛋白酶谱法分析胃蛋白酶的功效.docVIP

光密度定量蛋白酶谱法分析胃蛋白酶的功效 目录 TOC \o 1-9 \h \z \u 目录 1 正文 1 文1：光密度定量蛋白酶谱法分析胃蛋白酶的功效 1 1、仪器与试药 2 2、试验方法 3 3、结果 5 4、讨论 7 文2：不同品种绞股蓝同功酶谱初步研究 8 1 器材与方法 8 2 方法 10 3 结果 13 4 讨论 14 参考文摘引言： 17 原创性声明（模板） 18 文章致谢（模板） 19 正文 光密度定量蛋白酶谱法分析胃蛋白酶的功效 文1：光密度定量蛋白酶谱法分析胃蛋白酶的功效 胃蛋白酶于1836年由泰奥多尔·施旺发现，是一种疗效确切的助消化药，中国、美国、欧洲等药典均有收载。临床用于因食蛋白性食物过多所致消化不良、病后恢复期消化功能减退以及慢性萎缩性胃炎、胃癌、恶性贫血而导致的胃蛋白酶缺乏等症。根据《中国药典》2015年版(二部)[1]，胃蛋白酶提取自猪、羊或牛的胃黏膜，每克胃蛋白酶中含蛋白酶活力不得少于3800单位。胃蛋白酶在胃酸参与下将蛋白质分解成蛋白胨及少量多肽，主要用于消化不良、食欲缺乏等[2，3] 目前对胃蛋白酶功效评价的主要方法为《中国药典》2015年版中的效价测定方法[4]，另外常采用的方法有福林酚法等[5，6]。这些方法均通过紫外-可见分光光度法测定底物与酶反应过程中底物量的减少或产物量的增加直接或间接表征酶的活性。然而，该方法无法检测样品中胃蛋白酶的实际含量，无法反映胃蛋白酶的比酶活，因此可能引入低质量胃蛋白酶(比活力低，杂蛋白多)投料的风险。如何快速直观的同时针对酶活性及比酶活两个指标开展酶的功效评价是目前技术发展的主要需求。明胶-SDS-聚丙烯酰胺凝胶(gelatin-SDS)的蛋白酶活性分析方法可直接在电泳胶上准确地鉴定出具有蛋白酶活性的蛋白带，从而了解其特性。此法具有灵敏度高、结果直观、检测方便等优点，因而得到广泛的应用，并不断被改进[7，8]。然而，该方法目前仅能对具有蛋白酶活性的成分进行定性分析，而无法定量，同时该方法通过复性电泳展示蛋白酶活性，在一定程度上影响了酶的原始活性状态，不能相对客观地反映样品中酶的实际功效状态，为此，我们采用光密度分析方法，结合活性电泳技术对这一方法进行了改进，并针对胃蛋白酶开展了相关分析。 1、仪器与试药 仪器与试剂 仪器:Bio-RadMini-ProteanTetraCell电泳槽;Bio-RadPowerPacTMBasic电泳仪;玻璃板;离心机;恒温培养箱;脱色摇床等。 对照品:胃蛋白酶(批号:SLBQ3760V，分子量35kDa)，购自Sigma公司;血清白蛋白(牛)(来源:中检院，批号:140619-201622，蛋白含量:/瓶);蛋白质MarkerⅣ(～116kDa，批号:C600525，上海生工公司)。试剂:水为MilliporeQ-POD制备的纯化水，其他试剂均为分析纯。样品:4个生产厂家的胃蛋白酶原料。 样品溶液制备 选取胃蛋白酶生产企业提供的4份原料药，分别命名为YL1～YL4。 原料溶液制备:精密称取原料50mg，置100mL量瓶中，加入磷酸盐缓冲液溶解并稀释至刻度，制成含胃蛋白酶·mL-1的溶液，涡旋震荡使混匀，置4℃冰箱中冷藏待用(当日使用) 标准工作液:分别取Sigma胃蛋白酶适量，置于10mL量瓶中，加入磷酸盐缓冲液溶解并稀释至刻度，制成含胃蛋白酶、、、、、、、·mL-1的溶液备用。 2、试验方法 常规法比酶活测定 蛋白质含量测定参照《中国药典》2015年版(四部)通则0731蛋白质含量测定第二法福林酚法(Lowry法)。胃蛋白酶效价测定参照《中国药典》2015年版(二部)胃蛋白酶项下的效价测定方法。测得的效价结果与蛋白质含量结果的比值即为比酶活(IU·mg-1) 试验过程参考SDS经典方法[9]，其中分离胶配方(10mL10%):40%聚丙烯酰胺贮液，·L-1三羟甲基氨基甲烷(Tris)()，10%过硫酸铵，10%，四甲基乙二胺(TEMED)10μL，补水至10mL。浓缩胶配方(5mL5%):40%聚丙烯酰胺贮液，·L-1三羟甲基氨基甲烷(Tris)()，10%过硫酸铵，10%，四甲基乙二胺(TEMED)5μL，补水至5mL。样品与5×上样缓冲液(·;5mL50%甘油;1mL1%溴酚蓝;β-巯基乙醇;1mL10%SDS;蒸馏水)按4∶1比例混合均匀。上样10μL，起始电压60V，待样品中的溴酚蓝前沿进入分离胶后调电压至120V，电泳结束后使用1%考马斯亮蓝R250染色液染色，之后使用脱色液(乙酸-乙醇-水=1∶1∶8)脱色，进行图像扫描处理。 试验过程参考相关文献方法[10]，样品与5×上样缓冲液(·;5mL50%甘油;1mL1%溴酚