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黄连素促人牙髓干细胞成骨成牙本质细胞向分化的影响 目录 TOC \o 1-9 \h \z \u 目录 1 正文 1 文1：黄连素促人牙髓干细胞成骨成牙本质细胞向分化的影响 1 1、材料与方法 2 2、结果 5 3、讨论 6 文2：黄连素临床新用途 8 1 治疗心血管疾病 8 2 治疗非胰岛素依赖性糖尿病 9 3 治疗肠易激综合征（IBS） 9 4 防癌 9 5 利胆保肝降谷丙转氨酶 10 6 治疗胆囊炎 10 7 治疗皮肤病 10 参考文摘引言： 10 原创性声明（模板） 11 文章致谢（模板） 12 正文 黄连素促人牙髓干细胞成骨成牙本质细胞向分化的影响 文1：黄连素促人牙髓干细胞成骨成牙本质细胞向分化的影响 年轻恒牙牙根发育不完全，根尖孔未闭，牙本质壁较薄弱，临床上常见因龋病、外伤、牙体发育异常等造成牙髓感染坏死、根尖发育停止。传统治疗多采用根尖诱导成形术，但治疗后的患牙根管壁薄，易折断，远期预后不佳。再生性牙髓治疗是一种生物学治疗方法，其目的是替换受损牙髓组织，形成牙髓-牙本质复合体，支持牙根的继续发育[1] 随着组织工程技术的发展，牙源性干细胞促进牙髓-牙本质复合体再生受到关注。人牙髓干细胞是一种存在于牙髓组织的成体干细胞，具有自我更新和多向分化潜能[2]。2000年Gronthos等[3]首次从人第三磨牙分离培养了hDPSCs，与羟基磷灰石/磷酸三钙复合在裸鼠皮下形成牙髓-牙本质复合体，证明了其分化为成牙本质细胞的潜能。黄连素（Berberine）是一种异喹啉类生物碱，被广泛用于治疗消化系统疾病，具有抗菌、抗炎、抗肿瘤、降血糖等多重药理作用[4]。有研究显示黄连素可抑制破骨作用[5]，也可直接促进干细胞成骨分化[6]。本实验旨在探究不同浓度的黄连素对hDPSCs增殖和成骨/成牙本质细胞向分化的影响，为促进年轻恒牙牙根继续发育提供实验基础。 1、材料与方法 主要材料与设备 DMEM培养基（Gibco，美国）；胎牛血清（Gibco，美国）；%胰酶（Gibco，美国）；PBS溶液（凯基，中国）；成脂诱导培养基（Cyagen，美国）；CCK-8试剂盒（同仁，日本）；碱性磷酸酶检测试剂盒（碧云天，中国）；BCIP/NBT碱性磷酸酶显色试剂盒（碧云天，中国）；TRIzol(Invitrogen，德国）；PrimeScriptTM1stStrandcDNASynthesisKit(TaKaRa，日本）；SYbrGreeupermix(Bio-rad，美国）。Steril-GARD超净工作台（Baker，美国）；细胞培养箱（Thermo，美国）；流式细胞仪（Becton-Dickion，美国）；酶联免疫检测仪；VeritiPCR热循环仪；Step One Real-Time PCR Systemmachine。 方法 改良组织块酶消化法分离培养hDPSCs[7]。收集来自南京市口腔医院颌面外科拔除的完整、无龋的第三磨牙，志愿者年龄为18～25岁。在超净工作台内，用含10%双抗的PBS溶液冲洗离体牙3～4次，劈开牙体，取出新鲜牙髓，剪碎成约（1×1)mm2的小块。收集组织块，加入浓度为3g/L的Ⅰ型胶原酶，在37℃条件下消化30～60min。待牙髓消化成絮状，终止消化。在1000min，4℃条件下离心5min，弃上清。将组织块均匀平铺在25cm2的培养瓶底部，倒置培养瓶后加入5mL含20%胎牛血清的高糖DMEM，将培养瓶置于27℃、5%CO2、饱和湿度的培养箱中。4h后小心翻转培养瓶，使培养基均匀浸没贴壁的组织块。待原代牙髓细胞扩增后，将细胞转移至10cm的培养皿中。每3d更换1次培养基，第3～5代细胞用于进一步实验。 采用流式细胞术鉴定hDPSCs表型。选取第2代的hDPSCs，消化成细胞悬液。在流式管中加入5×105个细胞/管，PBS溶液洗1次，在1000min，4℃条件下离心5min，弃上清。加入100μLPBS溶液重悬细胞，按抗体说明书加入对应体积的抗体：FITCanti-humanCD31、CD34、CD45、CD90、CD146，AlexaFluor488anti-humanCD29、CD105MonoclonalAntibody，STRO-1MonoclonalAntibody混匀。4℃避光孵育30min。PBS洗2次，重悬，流式细胞仪上机检测。 将第3代hDPSCs以104个细胞/孔的密度接种在24孔板中。细胞生长至80%融合时，加入诱导培养基。（1）成骨分化潜能：每孔加入500μL成骨诱导培养基（DMEM+10%FBS、10mmol/Lβ-甘油磷酸钠、50g/L抗坏血酸、μmol/L地塞米松）每3d换液，7d后进行碱性