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对人EFTUD2启动子的鉴定和初步研究 目录 TOC \o 1-9 \h \z \u 目录 1 正文 1 文1：对人EFTUD2启动子的鉴定和初步研究 1 1、材料和方法 2 2、结果 6 3、讨论 8 文2：非小细胞肺癌中hMLH1启动子的甲基化 10 1资料与方法 10 参考文摘引言： 14 原创性声明（模板） 16 文章致谢（模板） 16 正文 对人EFTUD2启动子的鉴定和初步研究 文1：对人EFTUD2启动子的鉴定和初步研究 EFTUD2(elongation factor Tu GTP-bindingdo-main-containing 2）基因编码GTP酶。GTP酶是U5小核核糖核蛋白（small nuclear ribonucleoprotein，snRNP）即剪接体复合物的一个组成部分，与剪接体的其余部分一起发挥作用，可剪接前体mRNA(precuor messager RNA，pre-mRNA）以产生成熟mRNA。在剪接过程中，EFTUD2既可以直接参与剪接加工也可以参与剪接体snRNP的再循环过程。EFTUD2作为GTP水解酶的一种，作用类似于剪接体易位酶，既能介导RNA或蛋白质的构象变化，促进U1与前RNA的5′剪接位点碱基配对，又能促进U4与U6碱基配对的分离，从而构成5′剪接位点、U6及U2催化核心结构，而这一结构能避免剪接复合体过早活化。因此，EFTUD2是成熟剪接体组装生物过程中不可缺少的成分。 目前，关于EFTUD2基因突变体的研究已有相当多的报道。已经发现Treacher-Colli综合征、Nager综合征、CHARGE综合征或Feingold综合征患者存在EFTUD2突变[1，2，3，4]，并有研究表明EFTUD2基因突变可导致MFDGA型（mandibulofacial dysostosis Guion-Almeida，OMIM 610536）畸形[3，4，5]，而某些基因突变导致的表型差异都证实了有剪接体的参与。另有研究证实宿主基因转录后调控即前体mRNA剪接所导致的固有免疫相关蛋白差异性表达，在机体抵抗外来病毒感染入侵时起到了至关重要的作用[6，7]。因此，有理由认为EFTUD2基因在遗传畸形以及调节固有免疫方面扮演着重要角色。值得注意的是，现有的研究鲜有涉及该基因自身的表达和调节机制。基于以上事实，研究并阐明EFTUD2基因的表达调控机制具有重要的生物学意义。本研究拟对其启动子区域进行了预测、克隆、鉴定和初步分析，以期为进一步深入研究其调控机制奠定基础。 1、材料和方法 材料 人肝癌细胞HepG2为本实验室保存，常规培养使用含10%胎牛血清（Gibco公司，美国）的DMEM培养基（Gibco公司，美国），培养基添加了 mmol/L谷氨酰胺，100 U/mL青霉素，100μg/mL链霉素（Sigma公司，美国），于37℃5%CO2饱和湿度培养箱中培养。10 cm培养皿、96孔板（Corning公司，美国），PBS(Amerosco公司，美国），Trypsin-EDTA Solution(%Trypsin+ mmol/L EDTA，Hyclone公司，美国），GP-trafect-Mate转染试剂、质粒pUC57、psiCHECK-2(Genepharma公司，美国），DNA内切酶、DNA连接酶、DNAmarker(Fermentas公司，美国），琼脂糖、DNA凝胶回收试剂盒（北京天根生化科技有限公司），中量抽提试剂盒（杭州爱思进生物技术有限公司），酵母提取物、胰蛋白胨（OXOID公司，美国），卡那霉素（Sigma公司，美国），氨苄青霉素（Sigma公司，美国），无乙水醇、异丙醇、丙三醇、氯化钠、无水氯化钙、氢氧化钠（北京国药集团化学试剂有限公司），ClonExpress?Entry One Step Cloning Kit（南京诺唯赞生物科技公司），引物由上海吉玛制药技术有限公司合成，Dual-Luciferase报告基因检测系统试剂盒（Promega公司，美国） 方法 从UCSC数据库获取EFTUD2的cDNA和基因组序列，用在线BLAST程序进行序列比对，得出EF-TUD2基因外显子和内含子的组成。通过EPD真核启动子数据库在线软件预测目的基因启动子区域，利用Sequence Retrieval Tool得到EFTUD2启动子序列，并分别选取、、、 kb序列片段（ kb、EFTUD2 kb、EFTUD2 kb、EFTUD2 kb） 根据生物信息学分析得到的EFTUD2 kb启动子序列，设计覆盖目的基因全长的寡核苷酸引物，并根据预测的EFTUD2 kb、EFTUD2 kb、EFTUD2 kb启动子序列分别