探析山西太行黑山羊mtDNADLoop区遗传多样性.docVIP

探析山西太行黑山羊mtDNADLoop区遗传多样性 目录 TOC \o 1-9 \h \z \u 目录 1 正文 1 文1：探析山西太行黑山羊mtDNADLoop区遗传多样性 1 1、材料和方法 2 2、结果与分析 3 3、结论与讨论 6 文2：雄黄连木遗传多样性 9 1 材料与方法 10 2 结果与分析 11 参考文摘引言： 11 原创性声明（模板） 12 文章致谢（模板） 13 正文 探析山西太行黑山羊mtDNADLoop区遗传多样性 文1：探析山西太行黑山羊mtDNADLoop区遗传多样性 线粒体DNA是动物细胞核外唯一的遗传物质，具有基因结构简单、稳定，碱基突变率高，遗传上具有自主性及遵循严格的母系遗传等特点，为系统发育和遗传结构研究的良好素材[1]。其中，片段长1220bp的mtDNAD-环控制区（D-Loop）是mtDNA基因组中最主要的一段非编码区，控制mtDNA的复制和转录，受到进化的压力较小，进化速率最高，最具多态区域，尤其在高变区；由于D-Loop受自然选择影响较大，存在巨大变异，所以广泛应用于哺乳动物群体遗传多样性、物种亲缘关系、种群间系统进化分析和分子系统发生等方面的研究[2，3]。山西太行黑山羊（左权黑山羊）是一个重要的地方品种，分布广而分散、体型外貌多样、生产用途不突出，受各种因素的影响，目前群体数量急剧减少。合理保护和开发山西太行黑山羊品种资源是山西省畜牧产业发展的重要任务。 本研究在前期选育研究的基础上[4]，对其mtD-NAD-Loop进行测序分析，从系统发生方面研究山西太行黑山羊的遗传进化，旨在为山西太行黑山羊遗传资源保护、开发和杂交利用提供理论依据。 1、材料和方法 样品采集 试验样品采自左权县新世纪农业科技有限责任公司黑山羊种羊场核心选育群，随机选取健康成年黑山羊35只（检查系谱记录，避免选择亲缘关系较近的个体），采集其耳组织样品于冻存管中，冷藏箱保存带回实验室，-80℃冰箱保存。 基因组DNA的提取、扩增和测序 采用AXYGEN动植物基因组DNA小量制备试剂盒（AP-MN-MS-GDNA-250）进行总DNA提取。由于山羊的D环区位于细胞色素B基因（CYTB）和12SrRNA基因中间（图1），所以需要在CYTB基因和12SrRNA基因的保守区设计引物（引物序列为F:TTGATACCTGCTCCTCTTAG和R:CAGTCGAACAYCCCTAYRTT）扩增mtDNAD-Loop，片段大小约1500bp。 PCR扩增使用的是VazymePhantaMaxSuperFidelityDNAPolymerase扩增。首先对样品稀释到20ng/μL，再进行PCR扩增。轻弹混匀，瞬时离心收集管壁上的液滴至管底，在PCR扩增仪上进行PCR反应。PCR反应总体系为50μL，包括基因组DNA(20ng/μL)1μL，2×PhantaMaxBuffer25μL，PhantaMaxSuper-FidelityDNAPolymerase(1U/μL)1μL，dNTPMix(10mmol/L)1μL，正向引物（10μmol/L)2μL、反向引物（10μmol/L)2μL，ddH2O18μL。PCR反应条件为：95℃预变性3min;95℃变性15s，℃退火15s，72℃延伸45s，35个循环；72℃延伸5min，4℃保存。反应完成后，取3μLPCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，以确认PCR扩增片段。 PCR产物用AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒回收，具体操作按试剂盒说明书进行。在得到适合测序的PCR产物后，首先对其进行直接测序。测序PCR反应选用的试剂为ABI公司的测序试剂盒（），测序反应均按照使用手册进行。测序PCR产物的纯化采用乙醇沉淀方法，干燥后4℃避光保存，加入10μL甲酰胺，使纯化后的干粉充分溶解，随后置于PCR仪中进行变性反应，将变性后的样品采用3730XL测序仪进行测序。 测序数据分析 测序结果经DNAMAN比对、拼接和校正后，得到完整的序列。格式转换（Bioedit软件）后，用软件进行序列同源性比对，以MEGA文件格式保存。用分子进化遗传分析软件确定单倍型、多态位点，构建NeighborJoining(NJ）系统发育树。再利用软件对核苷酸多样度（Pi）、单倍型多样度（Hd）以及平均核苷酸差异数等进行统计分析。 2、结果与分析 扩增结果 对35只山西太行黑山羊mtDNAD-Loop区序列进行PCR扩增，经1%琼脂糖凝胶电泳检测，可见PCR扩增产物条带明亮清晰，无拖尾（图2）。扩增获得大小约1200bp的片段，与试验设计扩增片段长度大小相符，说明扩增效果良好。 山西太行黑山羊与其他山羊品种mtDNAD-Loop区的核苷酸组成分析