探讨线粒体COI基因片段用于准确鉴定小叶蝉亚科昆虫种类的可行性.docVIP

探讨线粒体COI基因片段用于准确鉴定小叶蝉亚科昆虫种类的可行性 目录 TOC \o 1-9 \h \z \u 目录 1 正文 1 文1：探讨线粒体COI基因片段用于准确鉴定小叶蝉亚科昆虫种类的可行性 1 1、材料与方法 2 2、结果与分析 4 3、讨论 5 4、结论 6 文2：奎屯市昆虫种类调查鉴定 6 1 调查地点与方法 8 2 调查结果 8 3 小结与讨论 9 参考文摘引言： 10 原创性声明（模板） 11 文章致谢（模板） 11 正文 探讨线粒体COI基因片段用于准确鉴定小叶蝉亚科昆虫种类的可行性 文1：探讨线粒体COI基因片段用于准确鉴定小叶蝉亚科昆虫种类的可行性 【研究意义】DNA条形码技术是昆虫基因组中一段被公认的、相对较短的DNA序列进行物种鉴定的一种分子生物学技术，可以快速、准确鉴定物种，对物种分类和系统发育研究有着重要意义[1]。种属的分类鉴定是小叶蝉亚科昆虫研究的重要内容，受形态学鉴定与传统分类的局限，叶蝉分类学的发展急需新技术的支撑[2]。DNA条形码的分子分类方法能够弥补传统形态学分类的缺憾[3]。【前人研究进展】基于线粒体DNACOI基因的条形码技术的物种鉴定手段在其他类昆虫鉴定中已有广泛应用[4，5，6，7]。张媛等[8]对鞘翅目昆虫COI基因的序列分析和系统进化树的构建指出，DNA条形码技术在鞘翅目昆虫分子系统发育研究中具有重要的应用价值。戴仁怀等[9]基于线粒体COI基因对中国常见的广头叶蝉亚科种类进行系统发育研究，为物种快速鉴定打下了基础。胡泽章等[10]研究证明，运用DNA条形码技术对小花蝽属昆虫进行物种快速分子鉴定是可行的。【本研究切入点】应用于DNA条形码工作中的基因很多，但线粒体细胞色素C氧化酶亚基基因(COI)拥有相对保守性的特点，种间变异较大，合适的序列长度能提供丰富的系统发育信息，是目前测序最多、结构和进化动力学研究较清楚的基因，已被广泛应用于近缘种间的系统分类研究[11]。小叶蝉亚科为叶蝉科第二大亚科，种类很多，而在小叶蝉亚科的低级阶元，近缘种普遍存在，根据传统分类学方法很难区分，采取新的特征和手段，可为近似种的鉴定提供更为可靠的证据。【拟解决的关键问题】应用DNA条形码技术对小叶蝉亚科物种进行鉴定，旨在弥补小叶蝉亚科传统分类方法的不足[12]，为近似种难以从形态上鉴定区分的问题提供更为可靠的依据[13]，该鉴定方法快速、方便且准确，对物种精确鉴定、生物多样性评估和系统发育关系方面的研究具有重要意义和科学价值[14]。为能快速、准确地鉴定小叶蝉亚科种类，通过PCR扩增对小叶蝉亚科5个族的线粒体COI基因片段序列进行测序和比对，然后将同源序列的碱基多样性及系统进化关系进行分析[15]，探讨线粒体COI基因片段作为DNA条形码准确鉴定小叶蝉亚科昆虫种类的可行性，以期为更进一步研究小叶蝉亚科昆虫分子鉴定技术提供理论依据和实践基础。 1、材料与方法 材料 叶蝉标本于2017年8月和2018年6月在贵州梵净山国家自然保护区采集，浸泡于无水乙醇中，保存于贵州师范大学喀斯特研究院6楼实验室，-20℃冰箱备用。选取的2种标本类型分别编号为YXYC(眼小叶蝉族Alebrini)与XLYC(小绿叶蝉族Empoascinisp.)。对比COI基因序列源于从基因库GenBank中下载的20种小叶蝉亚科昆虫COI基因序列(表1) 动物组织快速提取试剂盒(VWI)EasyPureGenomicDNAkit，北京全式金生物技术有限公司。 方法 取出无水乙醇保存的叶蝉标本，除去腹部和翅膀，然后将其余的动物组织使用无菌研磨棒将其磨成粉末状置于无菌的离心管中，然后按照动物组织快速提取试剂盒说明书提取总DNA，检测样品的浓度和纯度后马上保存于-20℃冰箱备用。 ①引物合成。通过文献查找筛选适合的COI通用引物[16]，引物均由上海生物工程有限公司合成。COI引物分为COIF(上游引物):GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG;COIR(下游引物):TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA。②PCR反应体系。2×EasyTaqPCuperMix(+dye)25μl，模板DNA2μl，上下游引物各1μl，加ddH2O21μl，总共50μl。PCR主要反应过程:94℃预变性3min;94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min，共有34个循环;最后72℃延伸10min。PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳检测合格后由上海生物工程有限公司进行直接测序。 测序后得到的结果使用Chromas进行读取与确认。运用进行序列的拼接与手工校正，确定分析的序列[17]。利用NCBI中的BLAST进行相似性检索，确定序列方向及目的片