探讨2型猪链球菌cps2J基因在遗传进化方面的关联性.docVIP

探讨2型猪链球菌cps2J基因在遗传进化方面的关联性 目录 TOC \o 1-9 \h \z \u 目录 1 正文 1 文1：探讨2型猪链球菌cps2J基因在遗传进化方面的关联性 1 1、材料与方法 2 2、结果 3 3、讨论 5 文2：探讨OPG基因与血管平滑肌细胞凋亡的关联性 5 1、　材料与方法 6 2、结果 8 3、　讨论 9 参考文摘引言： 11 原创性声明（模板） 12 文章致谢（模板） 12 正文 探讨2型猪链球菌cps2J基因在遗传进化方面的关联性 文1：探讨2型猪链球菌cps2J基因在遗传进化方面的关联性 猪链球菌是世界范围内养猪业重要的细菌性疾病之一，2型猪链球菌是一种人畜共患病原体，可引发仔猪和人类的败血症、脑膜炎[1，2，3]。目前认为猪链球菌毒力因子主要有荚膜多糖、溶血素、溶菌酶释放蛋白、胞外因子、谷氨酸脱氢酶、纤连结合蛋白以及黏附素等[1，2，3]。其中，gdh位于猪链球菌菌体细胞壁上，是一种新近发现的极其保守的种特异性抗原成分[3]，对细菌的致病性具有重要意义，不同血清型之间编码gdh的氨基酸序列同源性高达99%～100%。猪链球菌的临床菌株通常具有荚膜多糖，cps是2型猪链球菌感染宿主的重要毒力因子，是传统上用于血清分型的基础。根据荚膜抗原的差异，猪链球菌被分为35种血清型（1型至34型和1/2型）[4，5，6，7]。大多数国家患病猪中分离出的菌株主要属于2型血清型，其次是3、4、5、7、8和1/2型[8，9，10]。某些欧洲国家分离到较多的血清型9猪链球菌[10，11]。其中血清型2菌株的致病力最强，在人类中具有高度毒性。 2019年5月河南某猪场发生一起疑似猪链球菌疫情，断奶仔猪发生呼吸困难、脑膜炎及关节炎等症状，发病率约6%，部分病猪后期衰竭死亡。收集临床病料经细菌分离培养、PCR鉴定和cps2J基因序列分析，确定分离到一株2型猪链球菌，命名为HNTY1。本试验研究了2型猪链球菌的流行病学特点和遗传进化关系，为更好地防控本病提供科学依据。 1、材料与方法 病料与试验动物 试验于2019年5—10月在河南省农业科学院畜牧兽医研究所传染病研究室进行。病料来源于2019年5月河南省某规模化猪场具有疑似猪链球菌症状的断奶仔猪群，无菌采集濒死猪的脑脊液、肺脏、肝脏、心血和关节液等病料。 主要试剂 革兰氏染色液购自珠海贝索生物技术有限公司；胰蛋白胨大豆琼脂培养基、胰蛋白胨大豆肉汤培养基购自Difco公司。新生牛血清购自郑州益康生物工程有限公司；微量生化试管购自杭州滨河微生物试剂有限公司；2×TaqMasterMix、DL2000DNAMarker等PCR试剂购自宝生物工程（大连）有限公司。 细菌分离纯化 将无菌采集的组织病料接种于TSA平皿（含5%新生牛血清）中，置于37℃温箱培养18～24h，挑取TSA平皿上可疑的单个链球菌菌落进行革兰氏染色镜检，选取疑似链球菌的单菌落纯化培养后保存备用。 分型 根据参考文献[12，13，14]设计猪链球菌保守基因gdh和荚膜多糖基因cps2J的特异性引物（表1），由上海生工生物工程有限公司合成。设立灭菌去离子水为空白对照。将纯化菌株接种于含5%新生牛血清的TSA平皿，37℃恒温培养18h后，挑取单菌落于100μL灭菌超纯水中，旋涡混匀，100℃煮沸10min，12000min离心10min，取上清液提取DNA作为PCR模板备用。PCR体系如下：13μL2×TaqPCRmastermix、上下游引物各1μL、2μL模板、8μL超纯水。反应条件：94℃变性5min后，94℃45s、55℃45s、72℃30s进行35个循环，72℃延伸10min后，4℃保存。将PCR产物于1%琼脂糖凝胶电泳，取阳性产物送至上海生工生物工程有限公司测序。测序结果经ClustalW算法与NCBI网站2型猪链球菌参考序列（表2）进行同源性分析，并在软件使用Neighbor-JoiningMethod绘制系统发育进化树，Bootstrap数为1000。 表1猪链球菌PCR分型引物序列及相关信息 表2构建系统进化发育树的参考菌株 2、结果 细菌形态 经24h培养后，在含5%新生牛血清的TSA平皿上长出直径～、圆形、光滑、湿润、边缘整齐、半透明、灰白色略带蓝色荧光的小菌落，革兰氏染色为阳性圆形、卵圆形菌，呈单个、成对或短链状（图1）。将该菌株命名为HNTY1。 图1分离株的革兰氏染色镜检 鉴定 PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳后，扩增片段与预期设计大小一致，gdh基因和cps2J基因分别在689bp和537bp处扩增出阳性条带，均呈阳性；PCR产物测序结果与GenBank上gdh基因和cps2J基因参考菌株的序列同源性超过%，