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仪器分析高效液相色谱法;16-1 概述 高效液相色谱法(HPLC)是20 世纪70年代初发展起来的一种新型分离分析技术,随着不断改进与发展,目前已成为应用极为广泛的化学分离分析的重要手段。;16-1-1 高效液相色谱法; 和气相色谱一样,液相色谱分离系统也由两相---固定相和流动相组成。液相色谱的固定相能够是吸附剂、化学键合固定相(或在惰性载体表面涂上一层液膜)、离子交换树脂或多孔性凝胶;流动相是各种溶剂。; 被分离混合物由流动相液体推动进入色谱柱。依照各组分在固定相及流动相中的吸附能力、分配系数、离子交换作用或分子尺寸大小的差异进行分离。 色谱分离的实质是样品分子(以下称溶质)与溶剂(即流动相或洗脱液)以及固定相分子间的作用,作用力的大小,决定色谱过程的保留行为。; 依照分离机制不同,液相色谱可分为:液固吸附色谱、液液分配色谱、化学键合色谱、离子交换色谱以及分子排阻色谱等类型。; 它是在经典液相色谱基础上,引入了气相色谱的理论,在技术上采纳了高压泵、高效固定相和高灵敏度检测器,因而具备速度快、效率高、灵敏度高、操作自动化的特点。为了更好地了解高效液相色谱法优越性,现从两方面进行比较: ; 高效液相色谱法比起经典液相色谱法的最大优点在于高速、高效、高灵敏度、高自动化。高速是指在分析速度上比经典液相色谱法快数百倍。由于经典色谱是重力加料,流出速度极慢;而高效液相色谱配备了高压输液设备,流速最高可达 103cm·min-1。; 例如分离苯的羟基化合物,7个组分只需1min就可完成。 对氨基酸分离,用经典色谱法,柱长约170cm,柱径0、9cm,流动相速度为30cm3·h-1,需用20多小时才能分离出20种氨基酸;而用高效液相色谱法,只需lh之内即可完成。; (l)两者应用范围不同。气相色谱法分析对象只限于分析气体和沸点较低的化合物,它们仅占有机物总数的20％。关于占有机物总数近80％的那些高沸点、热稳定性差、摩尔质量大的物质,目前主要采纳高效液相色谱法进行分离和分析。 ;(2)液相色谱能完成难度较高的分离工作,因为: ①气相色谱的流动相载气是色谱惰性的,不参与分配平衡过程,与样品分子无亲和作用,样品分子只与固定相相互作用。而在液相色谱中,流动相液体也与固定相争夺样品分子,为提高选择性增加了一个因素。也可选用不同比例的两种或两种以上的液体作流动相,增大分离的选择性。; ② 液相色谱固定相类型多,如离子交换色谱和排阻色谱等,作为分析时选择余地大;而气相色谱并不估计的。 ③ 液相色谱通常在室温下操作,较低的温度,一般有利于色谱分离条件的选择。; (3)由于液体的扩散性比气体的小105倍,因此,溶质在液相中的传质速率慢,柱外效应就显得特别重要;而在气相色谱中,柱外区域扩张能够忽略不计。 (4)液相色谱中制备样品简单,回收样品也比较容易,而且回收是定量的,适合于大量制备。但液相色谱尚缺乏通用的检测器,仪器比较复杂,价格昂贵。在实际应用中,这两种色谱技术是互相补充的。; 综上所述,高效液相色谱法具有高柱效,高选择性,分析速度快,灵敏度高,重复性好和应用范围广等优点。 目前高效液相色谱法已被广泛应用于分析对生物学和医药上有重大意义的大分子物质,例如蛋白质、核酸、氨基酸、多糖类、植物色素、高聚物、染料及药物等物质的分离和分析。 高效液相色谱法的仪器设备费用昂贵,操作严格,这是它的主要缺点。 ;16-2 高效液相色谱仪; 高效液相色谱仪的结构示意见图16-2,一般可分为5个主要部分:高压输液系统,进样系统,分离系统,检测系统和记录系统。此外还配有辅助装置:如梯度淋洗,自动进样及数据处理等。 ;16-2-1 高压输液系统;(3)梯度洗脱装置;外梯度: 利用两台高压输液泵,将两种不同极性的溶剂按一定的比例送入梯度混合室,混合后进入色谱柱。 内梯度: 一台高压泵, 通过比例调节阀,将两种或多种不同极性的溶剂按一定的比例抽入高压泵中混合。; 梯度洗脱的实质是通过不断的变化流动相的强度,来调整混合试样中各组分的k’值,使所有谱带都以最佳平均k’值通过色谱柱。它在液相色谱分离中所起的作用相当于气相色谱中的程序升温,所不同的是,在梯度洗脱中溶质k’值的变化是通过改变溶剂的极性、pH和离子强度来实现的,而不是借助改变温度来实现的。;16-2-2 进样系统;16-2-3 分离系统;1