高三生物一轮复习学案：血红蛋白的提取与分离 .docxVIP

第 PAGE 4 页 共 NUMPAGES 4 页 专题5 课题3 血红蛋白的提取和分离（一） 1．基础知识：蛋白质的物化理性质：形状、大小、电荷性质和多少、溶解度、吸附性质、亲和力等千差万别，由此提取和分离各种蛋白质。 1．1凝胶色谱法：也称做分配色谱法，是根据相对分子质量的大小分离蛋白质的有效方法。 （1）原理：分子量大的分子通过多孔凝胶颗粒的间隙，路程短，流动快；分子量小的分子穿过多孔凝胶颗粒内部，路程长，流动慢。 （2）凝胶材料：多孔性，多糖类化合物，如葡聚糖、琼脂糖。 （3）分离过程：混合物上柱→洗脱→大分子流动快、小分子流动慢→收集大分子→收集小分子 ＊洗脱：从色谱柱上端不断注入缓冲液，促使蛋白质分子的差速流动。 1．2缓冲溶液 （1）原理：由弱酸和相应的强碱弱酸盐组成（如H2CO3－NaHCO3，NaH2PO4/Na2HPO4等），调节酸和盐的用量，可配制不同pH的缓冲液。 （2）缓冲液作用：抵制外界酸、碱对溶液pH的干扰而保持pH稳定。 1．3电泳：指带电粒子在电场的作用下发生迁移 的过程。 （1）原理：不同蛋白质的带电性质、电量、形状和大小不同，在电场中受到的作用力大小、方向、阻力不同，导致不同蛋白质在电场中的运动方向和运动速度不同。 （2）分离方法：琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳等。 （3）分离过程：在一定pH下，使蛋白质基团带上正电或负电；加入带负电荷多的SDS，形成“蛋白质－SDS复合物”，使蛋白质迁移速率仅取决于分子大小。 2．实验设计 2.1蛋白质的提取和分离一般分为哪些基本步骤？样品处理、粗分离、纯化、纯度鉴定。 思考：是否所有种类的蛋白质的提取和分离都是这样的？为什么？ 不是。因为蛋白质的来源和性质不同，分离方法差别很大。 2.2选择实验材料 （1）你认为鸟类血液和哺乳动物血液中，最好哪种血液来提取血红蛋白？为什么？ 哺乳动物血液。因为该细胞中没有细胞核，血红蛋白含量高。 （2）血液由血细胞和血浆两部分组成。血细胞中红细胞数量最多，细胞的含量最高的化合物是 血红蛋白 , 该化合物是由 两条 α—肽链 和 两条β —肽链构成的，其中每个亚基中都含有一个能与O2和CO2结合的 亚铁血红素 基团。（3）从红细胞中分离出血红蛋白的过程为：洗涤红细胞、释放血红蛋白、分离血红蛋白、透析。 2.3样品处理: ①红细胞的洗涤：目的：去除杂蛋白(如血浆蛋白)，获得纯净红细胞。 过程：血样低速短时间离心→吸出上层透明黄色血浆(含血浆蛋白)，将下层暗红色的红细胞液体倒入烧杯→加入五倍体积的生理盐水→再低速短时间离心→重复三次，直至上清液不再呈现黄色→得到纯净红细胞。 注：为防止血液凝固，在采血容器中要预先加入抗凝血剂柠檬酸钠。 生理盐水作用：能保持红细胞渗透压稳定而不至于破裂。 洗涤次数过少，无法除去血浆蛋白； 离心速度过高和时间过长会使白细胞等一同沉淀，达不到分离的效果。 ②血红蛋白的释放：目的：使红细胞破裂，释放血红蛋白。 过程：红细胞加蒸馏水到原血液的体积→加 40%体积的甲苯→搅拌→红细胞破裂，释放血红蛋白 注：蒸馏水作用：使红细胞吸水涨破。 甲苯作用：溶解细胞膜，加速红细胞破裂并释放出血红蛋白。 ③分离血红蛋白溶液：目的：经过离心使血红蛋白与其他杂质分离开。 过程：混合液离心→用滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层→分液漏斗中静置片刻→分离出下层的红色透明液体（血红蛋白溶液）。 试管中混合液离心后分为四层，从上往下数：第 1 层：无色透明的甲苯层；第 2 层：白色薄层固体，是脂溶性物质的沉淀层；第 3 层：红色透明液体，是血红蛋白的水溶液；第 4 层：暗红色的杂质沉淀层。 2.4粗分离——透析：①目的：除去样品中相对分子质量较小的杂质。 ②原理：透析袋能使小分子自由进出，而将大分子保留在袋内。 ③方法：将血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋放入一定量适宜浓度的磷酸缓冲液中，透析 12h。 思考：为何使用pH＝7的磷酸缓冲液？为什么缓冲液量远多于血红蛋白溶液量？ 维持血红蛋白的正常特性。有利于杂质分子充分地向外扩散。 总结：通过以上过程，红细胞中的血红蛋白就被提取出来。但其中还含有其他种类的蛋白质分子（如呼吸酶等）。怎样将杂蛋白与血红蛋白分离开来呢？纯化——凝胶色谱。 2.5纯化——凝胶色谱操作 （1）目的：通过凝胶色谱法将相对分子质量不同于血红蛋白的杂蛋白除去。 （2）过程：①凝胶色谱柱的制作 ②凝胶色谱柱的装填：①装柱前要 将色谱柱垂直固定在支架上 。②因为 干的凝胶和用缓冲液平衡好的凝胶的体积差异很大 ，所以装柱前需要根据色谱柱的内体积计算所需要的凝胶量。③在装填凝胶柱时，要尽量紧密。 ③样品的加入和洗脱： 调节缓冲液面：打开色谱柱下端的流出口，使柱内凝胶面上的缓冲液缓慢下降到与凝胶面平齐，