实验二 琼脂糖凝胶电泳检测DNA.docxVIP

植物基因组DNA提取质量鉴定 一、实验目的 掌握琼脂糖凝胶电泳别离DNA的原理和方法二、实验原理 1、某物质在电场作用下的迁移速度叫做电泳的速率，电泳的速率与核酸分 子大小和构型有关。分子质量越小跑得越快，紧密构型快于松散型开环分子或线 性分子，从而可以别离大小不同的DNA或RNA分子。DNA分子在碱性缓冲液 中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动。 2、琼脂糖是一种线性多糖聚合物，可以形成具有刚性的滤孔，凝胶孔径的 大小决定于琼脂糖的浓度。浓度越高，孔隙越小，其分辨能力就越强。DNA分 子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应。不同DNA的分子量大小 及构型不同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带。 表1琼脂糖凝胶的别离范围 琼脂糖浓度（％） 线型DNA分子的别离范围（Kb） 0.3 5?60 0.6 1?20 0.7 0.8-10 0.9 0.5-7 1.2 0.9?6 1.5 0.2-3 2 0.1-2 三、实验器材、材料和试剂1、仪器 电泳仪；电泳槽；灌胶模具等2、试剂 电泳缓冲液：Tris-硼酸（TBE）； Tris-乙酸（TAE）； Tris-磷酸（TPE）。 6X上样缓冲液：电泳指示剂漠酚兰在碱性液体中呈紫兰色，一般与蔗糖、 甘油或聚蔗糖400组成上样缓冲液。作用：①增加样品比重，以确保DNA均匀 沉入加样孔内。②形成肉眼可见的指示带，预测核酸电泳的速度和位置。③使样 品呈色，使加样操作更方便。 核酸染色剂：10 mg/ml溟化乙锭（3, 8-二氨基-5-乙基6苯基菲咤溟盐Ethidium Bromide, EB),它是一种荧光染料，EB分子可嵌入核酸双链的碱基 对之间，在紫外线激发下，发出红色荧光。其荧光强度与DNA的含量成正比。 据此可粗略估计样品DNA浓度。琼脂糖凝胶加入EB染色，紫外可见核酸电泳 -4+FTp o DNA marke亡 WNA/HindIII四、操作步骤 .凝胶制备：制备0.8%琼脂糖凝胶。称取适量琼脂糖加入40 mL0.5xTAE, 加热至琼脂糖全部熔化，冷却至50-60C时，加入EB至终浓度0.5(ig/mL (或 5川/100 ml琼脂糖胶)。缓慢倒入胶板，待胶凝固后拔出梳子。 .加样：取5 ilUDNA样液、以及DNA marker,分别与1 pil上样缓冲液混 匀，用微量移液器小心加入样品槽。 .电泳：接通电源，切记靠近加样孔的一端为负，电压为1?5V/cm (长度 以两个电极之间的距离计算)，待漠酚兰移动到凝胶2/3位置，停止电泳。 .结果观察：紫外透射分析仪下观察DNA条带。 五、考前须知 1、考前须知：EB是致癌物质，切勿用手接触，更不要污染环境。 2、加热琼脂糖凝胶时应使其完全溶解至透明状。 3、用于观察的紫外光有3种波长，一般使用中波紫外光(302 nm)；短波 紫外光(254 nm)观察效果较好，但对DNA的破环很大；长波紫外光(366 nm)： 回收。 六、附录 50xTAE： 2M Tris-HAc, 100mM EDTA (pH8.0 )1L50XTAE ： Tris 碱 242.3 g, 57.1 ml 的冰醋酸，100 ml 0.5 M EDTA (pH8.0)2322 2027 564 1252322 2027 564 125 3 67 )■ 115 p 345 b 296 XDNA/Hindlll marker