第八章 蛋白质和氨基酸的测定 第二节 蛋白质的测定.pptVIP

（二） 微量凯氏定氮法 1、原理及适用范围同前 2、与常量法不同点： 加入硼酸量有50 ml 10 ml, 滴定用盐酸浓度由0.1 mol/L 0.01 mol/L , 可用微量滴定管。 3、蒸馏装置。 微量凯氏定氮装置 1.蒸汽发生器；2.安全管；3.导管；4.汽水分离器；5.进样口；6.玻璃珠；7.反应管；8.隔热套；9.吸收瓶；10.冷凝管 注意事项 1 蒸馏前给水蒸汽发生器内装水至2/3体积处,加甲基橙指示剂数滴及硫酸数毫升,以使其始终保持酸性,这样可以避免水中的氨被蒸出而影响测定结果。 ２、20g/L硼酸吸收液每次用量25mL,用前加入混合指示剂２滴。 ３、在蒸馏时，蒸汽发生要均匀充足。蒸馏过程中不得停火断汽，否则将发生倒吸。 ４、加碱要足量，操作要迅速；漏斗应采用水封措施，以免氨由此逸出损失。 （三） 自动凯氏定氮法 1、原理及适用范围同前 2、特点： （1）消化装置用优质玻璃制成的凯氏消化瓶，红外线加热的消化炉。 （2）快速：一次可同时消化8个样品，30分钟可消化完毕。 （3）自动：自动加碱蒸馏，自动吸收和滴定，自动数字显示装置。可计算总氮百分含量并记录，12分钟完成1个样。 北京福德泰和科技有限公司 产品名称： 凯氏定氮仪 ????????????????????????????????????????????? 二、双缩脲法 　　传统的凯氏定氮法应用范围广，灵敏度高、准确，不要大仪器，但费时间，有环境污染。 快速测定方法：双缩脲法、 紫外分光光度法、 染料结合法、 水杨酸比色法等。 1. 原理 脲（尿素）NH2—CO—NH2 加热至150-160℃时，两分子缩和成双缩脲。 双缩脲能和硫酸铜的碱性溶液生成紫色络和物，这种反应叫双缩脲反应。（缩二脲反应） NH2—CO—NH—CO—NH2 + NH3 NH2—CO—NH2 + NH2—CO—NH2 蛋白质分子中含有肽键 —CO—NH— 与双缩脲结构相似。在同样条件下也有呈色反应，在一定条件下，其颜色深浅与蛋白质含量成正比，可用分光光度计来测其吸光度，确定含量。（560nm）注：测蛋白质时叫双缩脲法，并不另加双缩脲。样品不用消化 3.主要仪器： 分光光度计，离心机（4000 r/min） 4. 试剂： (1) 碱性硫酸铜溶液 (2) 四氯化碳 2. 方法特点及应用范围 本法灵敏度较低，但操作简单快速，故在生物化学领域中测定蛋白质含量时常用此法。本法亦适用于豆类、油料、米谷等作物种子及肉类等样品测定。 说明及注意事项如下： (1)有大量脂类物质共存时，会产生混浊的反应混合物．可用乙醚或石油醚脱脂后测定。 (2)在配制试剂加入硫酸铜溶液时必须剧烈搅拌，否则会生成氢氧化铜沉淀。 (3)蛋白质的种类不同，对发色程度的影响不大。 (4)当样品中含有脯氨酸时，若有大量糖类共存，则显色不好，测定结果偏低。 三．紫外吸收法 1．原理：利用蛋白质的特有基团， │ R （— NH—CH—CO） 对紫外光有吸收作用在280 nm下，吸光度与蛋白质浓度(3～8 mg/mL)成直线关系，求含量。 2．适用范围：常用于生物化学工作，因为干扰因素多，故在食品分析领域应用不广泛。 3．主要仪器： ① 紫外分光光度计 ② 离心机（3000 — 5000 r/min） 4．操作：用凯氏法测定作标样做标准曲线 5．操作方法：采用凯氏法测出的蛋白质样品为标准样绘标准曲线。 注意事项 A、蛋白质的种类对发色程度的影响不大。 B、含脂肪高的样品应预先用醚抽出弃去。 C、样品中有不溶成分存在时，会给比色测定带来困难，可预先将蛋白质抽出后再进行测定。 D、当肽链中含有脯氨酸时，若有多量糖类共存，则显色不好，会使测定值偏低。 E、由于许多非蛋白质成分在紫外光区也有吸收作用，加之光散射作用的干扰，故在食品分析领域中的应用并不广泛 。 四、染料结合法 在特定的条件下，蛋白质可与某些染料（如胺墨10B或酸性橙12等）定量结合而生成沉淀，用分光光度计测定沉淀反应完成后剩余的染料量可计算出反应消耗的染料量，进而可求得样品中蛋白质含量。 注意事项： (1)取样要均匀。 (2)脂肪含量高的样品，应先用乙醚脱脂，然后再测定。 (3)在样品溶解性能不好时，也可用此法测定。 (4)本法具有较高的经验性，故操作方法必须标准化。 (5)本法所用染料还包括橙黄G和溴酚蓝等。 (6)本法适用于牛乳、冰淇淋、酪乳、巧克力饮料，脱脂乳粉等食品。 五、水杨酸比色法 样品中的蛋